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维生素E（VE）含量检测试剂盒实验解决方案

原理

维生素E（VE）是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是生物体中最主要的抗氧化剂之一，能阻止不饱和脂肪酸受到过氧化作用的损伤，维持不饱和脂肪酸细胞膜的完整性和正常功能，具有延缓衰老、预防溶血性贫血作用，在医药、化妆品、保健品、食品行业具有较高的应用价值。VE还原Fe3+为Fe2+，Fe2+与1,10-菲罗啉产生有色络合物，在530nm有特征吸收峰。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测530nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·恒温水浴锅、离心机、涡旋震荡仪

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ExtractionBuffer有刺激性气味，ReagentⅠ有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，匀浆后用ExtractionBuffer定容至1mL，在漩涡震荡仪上震荡5min，于5,000g，25℃离心10min，取上清液待测。

细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎细胞3min（功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后在漩涡震荡仪上震荡5min，于5,000g，25℃离心10min，取上清液待测。

血清（浆）等液体样本：取0.1mL，加0.9mLExtractionBuffer，漩涡仪震荡上震荡5min，于5,000g，25℃离心10min，取上清液待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min，调节波长到530nm。可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂

对照孔（μL）

测定孔（μL）

样本上清

100

100

ReagentⅠ

20

20

ReagentII

0

20

ReagentIII

20

0

充分混匀，25℃孵育5min

ReagentIV

60

60

混匀，于530nm处测定吸光值，分别记为A对照、A测定，计算ΔA=A测定-A对照。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA小于0.02，可适当增大样本量；若反应体系产生沉淀，或者样本的ΔA大于0.5，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为：y=0.22x+0.0065,R2=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为ΔA。

（1）按照蛋白含量计算

VE(μg/mgprot)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×Cpr)=9.09×(ΔA-0.0065)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

VE(μg/g鲜重)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×W÷V样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷W

（3）按照细胞数量计算

VE(μg/104cell)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×N÷V样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷N

（4）按照液体体积计算

VE(μg/mL)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷V样×10=90.9×(ΔA-0.0065)

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入ExtractionBuffer体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万。

用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为：y=0.11x+0.0065,R2=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为Δ