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乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

乙酰辅酶A羧化酶（AcetylCoACarboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。CheKine?乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测660nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管

·水浴锅、低温离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentII：临用前配制；48T加入5mLReagentⅠ，96T加入10mLReagentⅠ，充分溶解，4℃避光保存可稳定1个月。

ReagentIII：临用前配制；48T加入4mL去离子水，96T加入8mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

ReagentIV：临用前配制；48T加入5mL去离子水，96T加入10mL去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定1周。

ReagentV：临用前配制；48T加入5mL去离子水，96T加入10mL去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定1周。

ReagentVI：即用型；室温保存。

注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性气味，ReagentVI具有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。

WorkingReagent：按去离子水：ReagentIV：ReagentV：ReagentVI=2：1：1：1的比例配制，现用现配。

Standard：即用型；10μmol/mL标准磷贮备液，使用前，平衡到室温。4℃保存。

0.5μmol/mLStandard：取50μLStandard加950μL去离子水，充分混匀。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

将ReagentⅠ、II、III在37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）预热10min。

操作表（下述操作在1.5mL离心管中操作）：

试剂

空白孔（μL）

标准孔（μL）

测定孔（μL）

对照孔（μL）

样本

0

0

10

10

ReagentⅠ

0

0

0

90

ReagentII

0

0

50

0

ReagentIII

0

0

40

0

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）准确反应30min后，90℃灭活5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10,000g，25℃离心5min，取上清。以下操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作：

上清液

0

0

20

20

0.5μmol/mLStandard

0

20

0

0

去离子水

20

0

0

0

WorkingReagent

180

180

180

180

充分混匀，37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）孵育30min后，冷却至室温，记录660nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。

注意：空白管和标准管只需做1-2次，每个测定管需要设一个对照管。实验之前建议选择2-3个预期差异