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乙醇含量检测试剂盒实验解决方案

原理

酒是含酒精（乙醇）饮料的统称，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。乙醇可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等，医疗上常用体积分数为70%~75%的乙醇作消毒剂。乙醇在化学工业、医疗卫生、食品工业、农业生产等领域都有广泛的用途。CheKine?乙醇含量检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD被还原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，通过450nm下测定吸光值变化可测得乙醇含量。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测450nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管

·水浴锅、离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentⅡ：临用前配制；48T加入3mLReagentIII，96T加入6mLReagentIII，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ReagentⅣ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

WorkingReagent：每孔准备160μLWorkingReagent，现配现用。吸取100μLReagentⅠ，50μLReagentII和10μLReagentIV，混合均匀。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

5μmol/mL标准品：临用前取58.4μL标准品加入941.6μL去离子水配成1,000μmol/mL的标准溶液；再取50μL1,000μmol/mL的标准溶液加入950μL去离子水配成50μmol/mL的标准溶液；再取100μL50μmol/mL的标准溶液加入900μL去离子水配成5μmol/mL的标准溶液用于下述标准孔的测定。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mL去离子水，冰浴匀浆，8,000g，室温离心10min，取上清液待测。

细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mL去离子水，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），然后8,000g，室温离心10min，取上清液待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂

标准孔（μL）

测定孔（μL）

样本

0

40

Standard

40

0

WorkingReagent

160

160

充分混匀，记录450nm处吸光值A1和37℃避光孵育10min后的吸光值A2，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定。计算ΔA=A2-A1。

注意：标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

乙醇含量的计算

按样本蛋白浓度计算：

乙醇(μmol/mgprot)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(Cpr×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

按样本鲜重计算：

乙醇(μmol/g鲜重)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(W×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W

按照细菌或细胞数量计算

乙醇(μmol/104)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(n×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷n

按样本体积计算：

乙醇(μmol/mL)=C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)=5×ΔA测定÷ΔA标准

C标准：标准溶液的浓度，5μmol/mL；V样：加入反应体系中的样本体积，0.025mL；V样总：提取液体积，1mL