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羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒实验解决方案

原理

羟脯氨酸（HYP）是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。CheKine?羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（微量法）可检测动物组织，细菌和培养细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，样本经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样本水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测560nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管、玻璃管

·水浴锅、离心机、烘箱

·去离子水、浓盐酸、无水乙醇、异丙醇、氢氧化钠

试剂准备

TissueExtractionBuffer：即用型；6mol/L盐酸，浓盐酸：去离子水（V/V）=1:1，室温保存。（自备）

CellExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：本试剂盒组分均有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Standard：即用型；0.5mg/mLL-羟基脯氨酸标准品；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

标准品制备：使用0.5mg/mLL-羟基脯氨酸标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号

Standard体积（μL）

去离子水体积（μL）

浓度（μg/mL）

Std.1

24μL0.5mg/mLStandard

376

30

Std.2

200μLofStd.1(30μg/mL)

200

15

Std.3

200μLofStd.2(15μg/mL)

200

7.5

Std.4

200μLofStd.3(7.5μg/mL)

200

3.75

Std.5

200μLofStd.4(3.75μg/mL)

200

1.875

Std.6

200μLofStd.5(1.875μg/mL)

200

0.938

Std.7

200μLofStd.6(0.938μg/mL)

200

0.469

Std.8

200μLofStd.7(0.234μg/mL)

200

0.234

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

动物组织：称取约0.2g样品于玻璃管，加入2mLTissueExtractionBuffer，置于110℃烘箱，水解6-12h，冷却后用氢氧化钠溶液调节ph为7.0左右，用去离子水定容至4mL，12,000g，25℃，离心20min，取上清待测。

细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，加入1mLCellExtractionBuffer，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后用浓盐酸调节ph为7.0左右，用去离子水定容至2mL，12,000g，25℃，离心20min，取上清待测。

血清中游离HYP提取：取0.1mL血清，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8,000g，4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.2mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。

注意：(1)如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

提取过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到560nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在1.5mL离心管中操作）：

试剂

空白管（μL）

标准管（μL）

测定管（μL）

样本

0

0

60

Standard

0

60

0

ReagentⅠ

60

60

60

混匀，室温静置20min

ReagentII

60

60

60

去离子水

180

120

120

充分混匀，60℃反应20min，取出后室温静置15min，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录560nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定。计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。

注