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总巯基测定试剂盒实验解决方案

原理

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和谷胱甘肽含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能测412nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·恒温水浴锅、制冰机、离心机

·去离子水、无水乙醇

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentII：临用前配制；48T加入0.8mL无水乙醇，96T加入1.6mL无水乙醇充分溶解备用。4℃避光可以保存一个月。

注意：ReagentII有毒，建议在通风橱进行实验。

Standard：临用前配制；加入1.3mL去离子水配制成25μmol/mL的谷胱甘肽标准品备用，4℃避光可保存2周。

标准品制备：使用25μmol/mL谷胱甘肽标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号

Standard体积

去离子水体积（μL）

浓度（μmol/mL）

Std.1

20μL25μmol/mLStandard

980

0.5

Std.2

500μLofStd.1(0.5μmol/mL)

500

0.25

Std.3

500μLofStd.2(0.25μmol/mL)

500

0.125

Std.4

500μLofStd.3(0.125μmol/mL)

500

0.063

Std.5

500μLofStd.4(0.063μmol/mL)

500

0.031

Std.6

500μLofStd.5(0.031μmol/mL)

500

0.016

Std.7

500μLofStd.6(0.016μmol/mL)

500

0.008

Blank

0

500

0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mL去离子水，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见分光光度计预热30min，调节波长到412nm。可见分光光度计用去离子水调零。

酶促反应（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂

测定孔（μL）

对照孔（μL）

标准孔（μL）

空白孔（μL）

样本上清

40

40

0

0

Standard

0

0

40

0

ReagentI

150

150

150

150

ReagentII

10

0

10

0

无水乙醇

0

10

0

50

混匀，25℃静置10min后，于412nm处测定吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只用测1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.8，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1.标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。

2.总巯基含量的计算：

按样本蛋白浓度计算：

总巯基含量(μmol/mgprot)=x×V样总÷Cpr=x÷Cpr

按样本鲜重计算：

总巯基含量(μmol/g鲜重)=x×V样总÷W=x÷W

按样本体积计算：

总巯基含量(μmol/mL)=x

V样总：加入去离子水体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

结果展示

Figure1.本试剂盒测定小鼠肝脏和小鼠肌肉中总巯基的含量

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CatalogNo.

ProductName

KTB1015

CheKine?α-葡萄糖苷酶活性检测试剂盒（微量法）