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中性蛋白酶（NP）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

中性蛋白酶（NP）在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。CheKine?中性蛋白酶（NP）活性检测试剂盒（微量法）可检测动物组织、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算NP活性。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测680nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管

·水浴锅、低温离心机、恒温箱

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentII：临用前配制；48T加入2.4mL去离子水，96T加入4.8mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃避光可保存3天。

ReagentIII：临用前配制；48T加入5mLReagentI，96T加入10mLReagentI，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），用不完的试剂4℃避光可保存3天。

ReagentIV：临用前配制；48T加入12mL去离子水，96T加入24mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃可保存3天。

ReagentV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ReagentII有刺激性气味，ReagentV有毒，建议在通风橱进行实验。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

动物组织：称取约0.1g样本，加入1mLReagentI，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到680nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

ReagentII、III、IV于30℃放置30min。

操作表（下述操作在1.5mL离心管中操作）：

试剂

空白孔（μL）

标准孔（μL）

测定孔（μL）

对照孔（μL）

样本

0

0

20

20

ReagentII

0

40

ReagentIII

40

0

混匀后置于30℃孵育10min

ReagentII

40

0

ReagentIII

0

40

混匀后8,000g，4℃离心10min，取上清

上清液

0

0

40

40

Standard

0

40

0

0

去离子水

40

0

0

0

ReagentIV

200

200

200

200

ReagentV

40

40

40

40

混匀后置于30℃孵育20min

取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录680nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。

注意：(1)空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。(2)如果反应较弱，ΔA测定小于0.002可适当加大样本量，或延长反应时间（20-30min），即第一步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改。如果ΔA测定大于0.5，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

NP活性的计算：

按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP(U/mgprot)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(Cpr×V反)÷T=125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

按样本鲜重计算：

酶活单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP(U/g鲜重)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(W×V反÷V提)÷T=125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

按样本体积计算：

酶活单位定义：30℃每毫升样品每分钟