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脂蛋白酯酶（LPL）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

脂蛋白酯酶（LPL）是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶，可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存，并在不同的组织表现出不同的生理意义。LPL水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能测400nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机、超声破碎仪

·丙酮

·研钵或匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentII：临用前配制；48T加入0.6mL丙酮，96T加入1.2mL丙酮溶解备用，用不完的试剂-20℃避光可以保存4周。

ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：5μmol/mL对硝基苯酚标准溶液，4℃避光保存。

注意：Standard有毒，建议在通风橱进行实验。

标准品制备：使用5μmol/mL对硝基苯酚标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号

Standard体积

ReagentI体积（μL）

浓度（μmol/mL）

Std.1

500μL5μmol/mLStandard

500

2.5

Std.2

500μLofStd.1(2.5μmol/mL)

500

1.25

Std.3

500μLofStd.2(1.25μmol/mL)

500

0.625

Std.4

500μLofStd.3(0.625μmol/mL)

500

0.313

Std.5

500μLofStd.4(0.313μmol/mL)

500

0.156

Std.6

500μLofStd.5(0.156μmol/mL)

500

0.078

Std.7

500μLofStd.6(0.078μmol/mL)

500

0.039

Blank

0

500

0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

动物组织：称取约0.1g样本，加入1mLReagentI，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

细胞：收集500万细胞至离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mLReagentI，冰浴超声波破碎细胞3min（功率300W，超声3s，间隔7s），然后10,000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到400nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂

对照孔（μL）

测定孔（μL）

标准孔（μL）

空白孔（μL）

样本上清

20

20

0

0

Standard

0

0

20

0

ReagentI

8

0

8

20

ReagentII

0

8

0

8

混匀，45℃孵育10min

无需孵育，继续加入以下试剂

ReagentIII

172

172

172

172

充分混匀，25℃静置2min，测定400nm处吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准和A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果A测定小于0.05可适当加大样本量。如果A测定大于2.0，样本可用ReagentI进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量，最后计算酶活时对公式进行修改。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。

LPL活性的计算：

按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：在45℃，pH7.5条件下，每mg蛋白每分钟水解产生1nmol4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL(U/mgprot)=x×V提取÷(V提取×Cpr)÷T×1,000