噬菌体疗法概论噬菌体基本生物学特性分析讲解.pptx

职业教育医学生物技术专业教学资源库噬菌体基本生物学特性分析噬菌体疗法概论

噬菌体基本生物学特性分析（一）PH和温度稳定性（二）宿主谱测定（三）MOI（四）一步生长曲线一、噬菌体基本生物学特性测定

噬菌体基本生物学特性分析一、噬菌体基本生物学特性测定噬菌体计数（1）双层平板法(最常用)100ul噬菌体和100ul宿主菌加入半固体，混合后铺在固体培养基，倒置培养，通常铺多个不同稀释倍数的噬菌体。选择30-300个噬菌斑的平板进行计数，原始效价=个数*10*稀释倍数

噬菌体基本生物学特性分析一、噬菌体基本生物学特性测定噬菌体计数（2）直接平板法（更简单）直接把100ul噬菌体和100ul宿主菌混合均匀后涂布铺在单层琼脂平板，倒置放入培养箱。

噬菌体基本生物学特性分析一、噬菌体基本生物学特性测定噬菌体计数（3）小液滴法（适宜较多样品）取20ul噬菌体原液到180ul稀释液中进行多梯度倍比稀释，取20ul噬菌体液与20ul菌液充分混匀后，点滴到琼脂平板上，风干后，倒置培养，可在10-12mm大小的圆形菌苔形成可见的噬菌斑。选择3-30个噬菌斑的平板进行计数，原始效价=个数*50*稀释倍数

噬菌体基本生物学特性分析一、噬菌体基本生物学特性测定（一）PH和温度稳定性1.温度稳定性将100ul噬菌体液(1×108PFU/mL)加入到900ul的SM缓冲液中(提前在不同温度预热)，然后将混合液放置在不同的温度下(4℃,28℃,37℃,50℃,60℃和70℃)孵育1h,用双层平板法检测噬菌体的滴度。临床意义：（1）确定噬菌体的最适消毒温度，为噬菌体制剂提供选择（2）生产环境的温度调整（环境、饲槽水料温度等）

噬菌体基本生物学特性分析一、噬菌体基本生物学特性测定（一）PH和温度稳定性2.PH稳定性将100ul噬菌体液(1×108PFU/mL)加入900ul不同pH值(1-12)的的SM缓冲液中，然后在37℃孵育1h。孵育后，用双层平板法检测噬菌体的滴度。用下列公式对噬菌体的存活率进行计算：噬菌体存活率=(孵育后滴度)/(初始滴度)。临床意义：判断其是否可通过饲喂达到杀菌效果，以及是否需要包装噬菌体进行治疗

噬菌体分离纯化及基本生物学特性分析二、温度和PH稳定性1.温度稳定性将100ul噬菌体液(1×108PFU/mL)加入到900ul的SM缓冲液中(提前在不同温度预热)，然后将混合液放置在不同的温度下(4℃,28℃,37℃,50℃,60℃和70℃)孵育1h,用双层平板法检测噬菌体的滴度。2.PH稳定性将100ul噬菌体液(1×108PFU/mL)加入900ul不同pH值(1-12)的的SM缓冲液中，然后在37℃孵育1h。孵育后，用双层平板法检测噬菌体的滴度。用下列公式对噬菌体的存活率进行计算：噬菌体存活率=(孵育后滴度)/(初始滴度)。临床意义：1.确定噬菌体的最适消毒温度，为噬菌体制剂提供选择2.生产环境的温度调整（环境、饲槽水料温度等）临床意义：判断其是否可通过饲喂达到杀菌效果，以及是否需要包装噬菌体进行治疗

噬菌体分离纯化及基本生物学特性分析三、宿主谱测定1）点滴法先在方平板上画6*6方格，各自编号，取200ul菌液加入半固体中混匀，把半固体倒入平板并全覆盖，在每个方格中点滴5ul噬菌体液体，噬菌体完全风干后，倒置放入培养箱。2）双层平板法通常点滴法用于初步测定，双层法用于进一步确定。

噬菌体分离纯化及基本生物学特性分析四、感染复数（MOI）感染复数：特定时间吸附的噬菌体与宿主菌比值。最佳MOI：在某条件获得噬菌体最高效价时的MOI。1）预先准备对数期的宿主菌2）按照MOI为10-4-102倍比提前稀释噬菌体3）吸取噬菌体和宿主菌各100ul到10ml培养液，震荡培养过夜4）培养液离心过0.22um滤膜5）双层平板法测效价很多试验表明MOI103时，宿主菌常因噬菌体过度侵染死亡。检测意义：探索噬菌体的最适MOI，利用于生产实践中获得最大的噬菌体数量，以达到高效杀菌。

噬菌体分离纯化及基本生物学特性分析五、一步生长曲线曲线定量描述烈性噬菌体生长规律的经典试验，反应噬菌体潜伏期长短，爆发量大小。1）将1ml菌液（对数期）与1ml噬菌体混合按MOI为0.1时，在摇床培养5min；2）4℃、5000g离心1min，弃掉上清，并用PBS洗两次；3）用10ml培养液重悬，放入摇床震荡培养；4）潜伏期内快而连续（每隔30s/1min）的采样计数；5）潜伏期后每隔5min取样计数，一般取样维持2h。潜伏期：噬菌体从吸附到宿主菌表面到释放子代噬菌体所需时间隐蔽期:宿主菌体内只有噬菌体的核酸及蛋白，还未组装、释放子代噬菌体。胞内积累期：隐蔽期后，人为的裂解宿主菌，裂解液呈现侵染性。平均裂解量=稳定期噬菌体