植物遗传转化技术.pptVIP

01020304除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；05安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。06Ti质粒的改造由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，即“卸甲”、“解除”、“缴械”其“武装”的Ti载体，记为Onc-，构建的Onc-载体叫“卸甲载体”。01卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体02例：pGV3850:是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来的03Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc左边界（LB）Ti质粒的其他部分右边界（RB）胭脂合成酶基因（Nos)pBR322（含AMPr）卸甲载体中间载体：带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为”中间载体”原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒中。01030204中间表达载体中间表达载体：是由中间载体（含选择标记）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。1嵌合基因（chimericgene）2就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。30102Ti质粒花椰菜花叶病毒DNA的CaMV的35s启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。CaMV的35s启动子中间表达载体-启动子及调控序列为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。0102目的基因01新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)02卡那霉素抗性基因(kanr)03潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素(hygr)04氨苄青霉素抗性(Ampr)05四环素抗性(Tcr)06庆大霉素抗性(Genr)中间表达载体-选择标记供植物转化体的选择标记：Cat（氯霉素乙酰移酶基因）Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因。植物遗传转化载体系统转化载体系统一元载体转化系统双元载体转化系统一元载体转化系统这类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体拼接未端载体（split-endvector,SEV）STEP01STEP02中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322一元载体转化系统-共整合载体共整合载体的特点是：中间载体Ti质粒的其他部分右边界（RB）胭脂合成酶基因（Nos)pBR322（含AMPr）左边界（LB）pBR322vector目的基因重组载体卸甲载体外源基因插入pGV3850的过程共整合载体一元载体转化系统-拼接末端载体拼接末端载体（sp1it-endvecter,SEV）1985年建立的，因它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。目的基因LIHnos基因MCSnptⅡTR-DNASper/Strr中间载体pMON200pMON200转基因整合到植物基因组中TL-DNA部分序列LIHpTiB6S3Kanr同源重组卸甲载体中间载体pMON200一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较共同点:两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于一元载体系统。不同点：受体Ti质粒与中间载体的结构不同。同源序列不同。SEV是更有效的共整合载体。共整合转化程序构建时比较困难。3124由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；一元载体转