猪瘟的间接免疫荧光实验.pptVIP

实验五猪瘟的间接免疫荧光实验

龙岩学院生命科学学院

2015.5.25一、实验目的：了解和掌握猪瘟的临床诊断方法和实验室诊断方法（间接免疫荧光法）。直接法---荧光素标记Ab直接检测01间接法---荧光素标记二抗02补体结合法---荧光素标记抗补体Ab03双结合法---两种荧光素标记Ab04荧光免疫显微技术二、实验原理：固定在载片上的待检病变组织与适当稀释的猪瘟阳性血清反应后，如果待检组织中有猪瘟病毒抗原就会与猪瘟阳性血清中的抗体特异性结合，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的的兔抗猪IgG二抗又可与猪瘟阳性抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见呈现绿色荧光。单击此处添加大标题内容异硫氰酸荧光素(FITC)能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。荧光二抗荧光素及其激发波长和发射波长01猪瘟病料、抗原片、FITC荧光标记的兔抗猪二抗、PBS缓冲液、猪瘟标准阴、阳性血清、封片介质:磷酸盐缓冲甘油、盖玻片、滤纸02荧光显微镜、摇床、移液器、吸管等三、试剂与仪器：生物薄片生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。荧光显微镜：四、IIF操作步骤：准备：取病猪的扁桃体，淋巴结、脾或其他组织一小片，用滤纸吸去外面的液体。用笔编号、标记。触片：取干净载玻片一块，稍为烘热，将组织小片的切面触压玻片，略加转动，作成压印置室温内干燥。或用所采的病理组织，做成切片。固定：滴加冷丙酮数滴，置–20℃固定15一20分。清洗：用PBS（pH7.2）洗涤3次，每次5min，阴干。第一次温育：滴加25ul稀释后的血清覆盖触片样品，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始室温温育30分钟。