出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第7部分：白色念珠菌.docx

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SN/T5760.7—2024

进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法

第7部分：白色念珠菌

1范围

本文件描述了进出口化妆品中白色念珠菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中白色念珠菌的快速检测。

本文件所能达到的检出限(LODm)为0.98CFU/10g(mL)~3.03CFU/10g(mL)。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

SN/T2206.8化妆品微生物检验方法第8部分：白色念珠菌SN/T5075化妆品微生物检验副样规范

3术语和定义

本文件没有需要得定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyriboucleicacid)

dAPCR:微滴式数字PCR(dmopletdigitalPayneraseChuinReactiom)ITS2:内转录间隔区2(internatranseribedspacer2)

PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)

5方法原理

针对白色念珠菌RNA编码基因(DNA)中的内转录间隔区2(ITS2)保守序列设计引物、探针。将一定浓度的引物、探针与模板DNA及反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个-20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩增。ITS2基因探针5端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1。利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴

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簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有白色念珠菌。

6设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

6.1恒温培养箱：30℃±1℃。

6.2冰箱：2℃-8℃、-20℃。

6.3均质器或乳液分散机(转速1000rmin以上)。

6.4电子天平：感量0.1g。

6.5高速微量离心机(最大离心力不小于10000g)。

6.6涡旋振荡仪。

6.7加热装置：95℃-100℃。

6.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.9无菌均质袋或均质杯。

6.10生物安全柜。

6.11ddPCR扩增仪及相关配套设备。

6.12移液器及配套吸头：100pL~1000pL、20μL~200μL、10pL-100pL喝比~10μL。

6.13离心管：2mL、1.5mL和0.2mL。

6.14阳性对照：白色念珠菌ATCC10231或等效菌株或含目的片段的DNA。

7材料与试剂

7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

7.2DNA提取液：见附录A中A.1。

7.3蛋白酶K(20mg/mL)。

7.4大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SCDLP)液体培养基：见附录A中A.2。

7.5真菌基因组提取试剂盒

7.6生理盐水：见附录A.3。

7.7ddPCR反应配套试剂。

7.8白色念珠菌ITS2编码基因特异性序列片段参见附录B,引物探针如下：Primer-F:5°-ACCGCTGGGTITCCTG-3

Primer-R:5-AGACCTAAGCCATTGTCAAAGC-3

Probe-P:5-FAM-TGAGCAATACGACTICGGTTTG-BHQ1-38检验程序

进出口化妆品中白色念珠菌ddPCR检验程序见图1。

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样品制备

样品制备

取10g或10L.样品加入90L.SCDUP增菌液

30℃±1℃.20h~72h

真菌DM提取

ddPCR检测

阴性阳性

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