氨基酸与蛋白质的一级结构.ppt

第五节蛋白质一级结构的测定01蛋白质结构概述一级结构测定方法同源蛋白质及结构进化镰刀型血红蛋白分子病02一、蛋白质的结构层次一级结构01四级结构02二级结构03三级结构04氨基酸05二、蛋白一级结构测定定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。前提：样品均一、纯度97%以上、已知分子量以传统氨基酸定序法决定蛋白质序列F.Sanger(1953,CambridgeU)Insulin胰岛素(A,Bchains)SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKTB-chainA-chain一级结构(Primarystructure)直接测定氨基酸测序：Edmandegradation F.Sanger(CambridgeU.)→Insulin胰島素(A,Bchains)如何定出一级结构：蛋白质的氨基酸顺序由cDNA序列反推氨基酸序列： 赖氨酸的解离及等电点计算HA2+A+A0A-等电点(isoelectricpoint,pI)：分子呈电中性时溶液的pH值。为兼性离子两侧解离基团的算术平均值。01中性氨基酸：酸性和碱性基团的算术平均值：pI=(pK’-COO-+pK’-NH2)/2，pI～602酸性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值pI=(pK’-COO-+pK’R-COO-)/2，pI～203碱性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值pI=(pK’-NH2+pK’R-NH2)/2，pI704pH=pI氨基酸呈电中性，电泳不移动pHpI氨基酸带正电荷，向阴极移动pHpI氨基酸带负电荷，向阳极移动在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多，泳动速度越快。不同pH值时所带电荷补充：化学性质”亚硝酸反应01烃基化反应02酰化反应03脱氨基反应04西佛碱反应05成盐成酯反应06成酰氯反应07脱羧基反应08叠氮反应09侧链反应10茚三酮反应11成肽反应12除Pro生成黄色化合物外,其它AA生成蓝紫色化合物（570nm）;与茚三酮反应(28)用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮水合茚三酮在近紫外区(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的?max＝275nm，苯丙氨酸的?max＝257nm色氨酸的?max＝280nm补充：特征光吸收氨基酸的结构通式为α氨基酸。蛋白质除含C,H,O外，还含有N。AA平均分子量为110。不同蛋白的含氮量皆在16%左右。只需测定N含量，N含量/16%即为蛋白含量。---凯氏定氮法的理论基础补充：含氮量稳定电泳：阴离子交换树脂-N(CH3)3OH，阳离子交换树脂-SO3H根据氨基酸的净电荷及R基的极性：滤纸层析：根据氨基酸的净电荷及质点大小：离子交换层析：薄层层析：根据R基的极性。原理：分配层析。第二节、氨基酸的分离分析层析法――色层分析法（色谱）01系统的组成固定相（静相）02流动相（动相）03分配定律――当溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数.此比值即分配系数（kd）。04分配层析的一般原理固定相：纤维素上吸附的水流动相：展层溶剂，有机相层析时，混合AA在两相中不断分配，疏水性强的AA在固定相水中溶解度较小，与水的作用力也较小，随展层剂的展层（移动）也移动较远距离（迁移率Rf大）。极性强的Rf值小，疏水性强的Rf大。分离、鉴定AA混合物的方法。一）纸层析01020304将下列每组混合物分别用正丁醇-醋酸-水进行纸层析，指出每组的相对迁移率。Val和Lys;Phe和Ser;Leu、Ala、Ser第三节肽（peptide）肽、肽键与肽链一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由几个到几十个氨基酸组成的肽称为寡肽，由更多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列