蛋白质分析技术第九章课件.pptx

蛋白质分析技术;学习目标;;01;蛋白质的分离纯化;尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求,纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高。;因标本而异。

;生物样本;细胞破碎方法;一、机械法;研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。;组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。;反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。

超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。

冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。;有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。

溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。;;超滤

透析;超滤和透析;透析;离心;差速离心;密度梯度离心;也称色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同，使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。

层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。;利用各蛋白质分子大小不同分离;样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得到分离。;不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳动速度越大。

;在电解槽中放入两性电解质，通电即形成一个由阳→阴逐步递增的pH梯度。pH=pI时，Pro净电荷=0，所以Pro将聚焦于相当于pI的pH带内。

;以高压电场为驱动力，以毛细???为分离通道。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。

;离子交换层析;利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。;二维电泳;等电聚焦电泳;双向电泳;方法;三、蛋白质分离纯化的条件;02;1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测——免疫印迹，Western印记杂交。;（1）首先做蛋白质的SDS电泳。

（2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。

（3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。

（4）显色。

本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。

;一、SDS电泳;二、蛋白质的电转移;三、靶蛋白质的免疫学检测