常用分子生物学技术的原理及应用.pptVIP

基因组文库筛选结果举例CBA第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五节功能性克隆(functionalcloning)定位克隆(positionalcloning)非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)克隆疾病相关基因的策略定义从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。功能性克隆应用生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。克隆方式功能互补试验(functionalcomplementationassay)（二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作①遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析②分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。0102第六节

遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel目录目录目录第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一节

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridizationBlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。分子杂交与印迹技术的原理0102复性RNADNA印迹技术探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。01RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。01蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。01二、印迹技术的类别及应用DNA点阵(DNAarray)斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA芯片技术(DNAchip)其他三种印迹技术的比较分子杂交实验目录③①②放射自显影照片DNA点阵第二节01聚合酶链反应02PolymeraseChainReaction03一、基本工作原理目录5?Primer15?Primer2Cycle2Cycle15?5?5?5?5?5?TemplateDNA5?5?5?5?5?5?5?5?Cycle35?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。01模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+02PCR体系基本组成成分变性0195?C02延伸0372?C04退火05Tm-5?C06三、PCR的基本反应步骤目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RN