基于mtDNA-cGAS-STING信号通路探讨RAD51抑制对三阴性乳腺癌免疫微环境的影响.pdf

华中科技大学硕士学位论文

摘要

目的：考察RAD51抑制(特异性抑制RAD51基因表达的核酸药物siRAD51及RAD51

重组酶小分子抑制剂B02)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞cGAS-STING信号通路的影

响及分子机制，并在体内外水平评价抑制RAD51的纳米核酸药物(siRAD51@HES-

SS-CH)及小分子抑制剂B02对TNBC增殖及免疫抑制性微环境的影响。

方法：为探索RAD51抑制对TNBC细胞中cGAS-STING信号通路的影响及分子机

制，首先选用小干扰RNA(siRAD51)处理以抑制人源TNBC细胞MDA-MB-231及鼠

源TNBC细胞4T1中的RAD51基因表达，小分子抑制剂B02处理以抑制RAD51重

组酶活性。采用Westernblot法检测TNBC细胞的先天免疫cGAS-STING信号通路

中cGAS、TBK1、IRF3、STING关键蛋白/磷酸化蛋白的水平，RT-PCR法检测信号

通路下游因子IFNβ、CCL5、CXCL10、ISG15的mRNA水平。siRAD51、B02处理

的4T1细胞提取全细胞及胞质部分的DNA纯化后，RT-PCR实验检测胞质部分的

DNA来源。免疫荧光染色检测mtDNA与线粒体的共定位情况。mtDNA合成抑制剂

二脱氧胞苷(ddc)消耗4T1细胞的mtDNA后，Westernblot法检测cGAS、TBK1、

IRF3、STING等关键蛋白/磷酸化蛋白的水平，RT-PCR法检测IFNβ、CCL5、CXCL10、

ISG15的mRNA水平。串联质谱标记法对siRAD51处理的MDA-MB-231细胞进行

蛋白质组学测序，使用GO和KEGG通路富集分析RAD51基因抑制后TNBC细胞

的蛋白组学变化。

为在体内水平评价RAD51抑制对TNBC肿瘤免疫微环境的影响，需实现siRNA的

体内有效递送。因此我们构建了一种新型的纳米核酸药物siRAD51@HES-SS-CH,其

采用基于羟乙基淀粉(HES-SS-CH)的纳米载体携载siRAD51。琼脂糖凝胶电泳法筛选

纳米载体HES-SS-CH与siRNA的合适配比。马尔文激光粒度仪检测纳米颗粒的粒

径、电势。CCK-8法检测纳米载体对4T1细胞的毒性情况。激光共聚焦显微镜成像

观察siRNA@HES-SS-CH进入TNBC细胞的情况。Westernblot法检测纳米核酸药物

沉默4T1细胞中RAD51基因的效果。在小鼠乳腺接种4T1细胞，构建了小鼠TNBC

原位肿瘤模型。使用小动物活体成像系统检测纳米核酸药物的体内分布情况。

III

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siRAD51@HES-SS-CH及小分子抑制剂B02连续给药后，测量肿瘤体积并Ki67免疫

组化染色考察对TNBC肿瘤增殖的影响。CD8免疫组化染色考察对TNBC肿瘤免疫

微环境的影响。

结果：经siRAD51、B02作用可显著抑制TNBC细胞中RAD51的表达。RAD51抑

制可导致TNBC细胞中的先天免疫cGAS-STING信号通路cGAS、TBK1、IRF3、

STING关键蛋白/磷酸化蛋白的水平升高，下游因子IFNβ、CCL5、CXCL10、ISG15

的mRNA水平升高。经siRAD51及B02处理，4T1细胞的胞质部分中核DNA(以

Nuc-Tert、Nuc-HK2、Nuc-NDUFV1、Nuc-PTGER2为代表)的含量基本没有变化;而线

粒体DNA(以mt-Dloop1、mt-Dloop2、mt-Dloop3、mt-ND4、mt-Cytb、mt-cox1为代

表)的含量明显增加。激光共聚焦显微镜成像结果显示，经siRAD51及B02处理后，

4T1细胞线粒体中的mtDNA与线粒体分离，释放入细胞质中，使胞质中的dsDNA

数量显著增加。二脱氧胞苷(ddc)处理可使4T1细胞中的mtDNA耗尽，在此条件下

显著降低了RAD51抑制所诱导的cGAS-STING信号通路激活水平。si