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猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要：猫杯状病毒（FCV）是一种高度传染性病毒，可引起猫群中严重的肠道疾病。为了快速、准确地检测FCV，本研究建立了一种基于荧光定量PCR（qPCR）的检测方法。该方法通过设计特异性的引物和探针，对FCV的N基因进行扩增，实现了对病毒核酸的定量检测。本研究首先对引物和探针进行了优化，并通过标准曲线法对检测灵敏度进行了评估。随后，该方法在临床样品中进行了初步应用，结果表明该检测方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的特点，为FCV的快速诊断和防控提供了有力工具。

猫杯状病毒（FCV）是一种属于杯状病毒科（Caliciviridae）的病毒，广泛存在于猫群中，可引起猫群中严重的肠道疾病。FCV的感染会导致猫出现腹泻、呕吐、脱水等症状，严重时甚至可导致死亡。随着宠物经济的快速发展，FCV的感染范围不断扩大，给养猫者的健康和经济造成了严重的影响。因此，建立一种快速、灵敏、特异的FCV检测方法具有重要的临床和公共卫生意义。荧光定量PCR（qPCR）作为一种高灵敏度的核酸检测技术，已被广泛应用于病毒检测领域。本研究旨在建立一种基于qPCR的FCV检测方法，以期为FCV的快速诊断和防控提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1病毒株和试剂

(1)本研究使用的猫杯状病毒（FCV）株来源于我国某宠物医院，经过病毒分离和鉴定，确认为FCV。该病毒株在实验室条件下具有良好的增殖能力和稳定性。在病毒培养过程中，我们采用了常规的细胞培养技术，使用猫肾细胞（MDBK）作为宿主细胞，确保病毒能够顺利增殖。病毒培养液为DMEM培养基，其中添加了10%的小牛血清和2%的胎牛血清，以及适量的抗生素和生长因子，以维持细胞的生长状态。

(2)实验过程中所使用的试剂包括qPCR试剂盒、DNA提取试剂盒、PCR引物和探针等。qPCR试剂盒购自美国ABI公司，包含荧光染料、反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分，能够满足荧光定量PCR实验的需求。DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，具有高效、快速、低污染等特点，适用于各种生物样本的DNA提取。PCR引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成，针对FCV的N基因设计，保证了检测的特异性。

(3)除了上述试剂外，实验中还使用了其他辅助试剂，如核酸纯化试剂盒、DNA标记试剂盒、电泳试剂盒、凝胶成像系统等。核酸纯化试剂盒用于纯化提取的DNA，确保其质量；DNA标记试剂盒用于标记PCR产物，便于后续的凝胶电泳分析；电泳试剂盒和凝胶成像系统则用于检测PCR产物的存在和大小。所有试剂均按照产品说明书进行操作，确保实验结果的准确性和可靠性。

1.2引物和探针的设计

(1)引物和探针的设计是构建荧光定量PCR检测方法的关键步骤。本研究针对猫杯状病毒（FCV）的N基因保守区域，利用生物信息学软件进行了序列分析，筛选出特异性高、扩增效率好的靶序列。通过对比分析不同序列的同源性，最终确定了引物和探针的序列。引物设计时，确保了上下游引物之间不存在二级结构，并避免了与宿主基因组序列的交叉，以保证检测的特异性。

(2)在引物和探针的合成过程中，我们采用了荧光标记技术，将荧光基团标记在探针的5端，以便于荧光定量PCR反应中荧光信号的检测。此外，为了保证引物和探针的稳定性和扩增效率，我们对其进行了熔点预测和Tm值优化。通过调整引物和探针的长度、碱基组成以及序列排列，确保了其在PCR反应中的最佳性能。

(3)为了验证引物和探针的特异性和灵敏度，我们对合成的引物和探针进行了预实验。实验结果显示，该引物和探针能够特异性地扩增出目标序列，且扩增效率高，无假阳性和假阴性结果。此外，通过梯度稀释实验，我们确定了该引物和探针的最低检测限为10fg/μL，满足实验需求。在后续的荧光定量PCR检测中，我们将继续优化引物和探针的性能，以提高检测的准确性和稳定性。

1.3qPCR反应体系和条件

(1)qPCR反应体系的建立是确保荧光定量PCR检测准确性和重复性的关键环节。本研究选用了一款高灵敏度的qPCR试剂盒，该试剂盒包含荧光染料、反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分。在实验过程中，我们首先对反应体系中的关键参数进行了优化，包括反应温度、循环次数、PCR扩增效率等。

具体而言，我们通过对比不同反应温度（60℃、62℃、64℃、66℃）对PCR扩增效率的影响，确定了最佳反应温度为64℃。在循环次数方面，我们对比了30次、35次、40次、45次循环对扩增曲线