DB21T 2251-2014 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法　.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2251—2014

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

MethodofRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirus

2014-03-07发布2014-05-07实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2251—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：于学武顾贵波陈瑶赵晓彤赵凤菊刘坤洋关乃鹏王珊珊刁贺军

王冰邓文超

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DB21/T2251—2014

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法的仪器和器材、试剂和材料、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。

本标准适用于猪流行性腹泻的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）BP：碱基对（basepair）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

4原理

PEDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

5仪器和器材

本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2~8℃,-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管、0.2mL离心管、微量移液器和吸头。

6试剂和材料

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DB21/T2251—2014

6.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。

6.2氯仿：4℃预冷。

6.3异丙醇：4℃预冷。

6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。

6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（士2）℃,高压灭菌15min。

6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。

6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。

6.8dNTP(2.5mmol/L)。

6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3′

下游引物R：5′-CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3′

6.10反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。

6.11反转录引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。

6.12阴性对照：DEPC水。

6.13阳性对照：PEDV细胞培养物。

6.14PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。

6.15TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。

6.16溴化乙锭。

6.17DL2000DNAMarker。

注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。

7操作步骤

7.1样品的采集、前处理、存放和运送

7.1.1采样注意事项

采样及样品前处理过程中应戴