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实验七过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定一、实验目的学习米氏常数（Km）的测定方法。2H2O2→2H2O+O2↑过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：012KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。02二、实验原理米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）Km11—=——.—+——vVmax[S]Vmax试剂1．0.05mol/L草酸钠标准液将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO45ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。约0.02mlKMnO4储存液称取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。004mol/LKMnO4应用液取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。01约0.05mol/LH2O2液取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/LKMnO4标定之，稀释至所需浓度。022mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。03操作步骤l．血液稀释吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/L的H2O22.0ml和25%H2SO42.0ml，分别用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。0102反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。加入物(ml)12345H2O2(约0.05mol/L)0.51.52.53.54.5蒸馏水4.03.02.01.0—血液稀释液0.50.50.50.50.537度保温5分钟25％硫酸2.02.02.02.02.00.004高锰酸钾依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO42.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。STEP4STEP3STEP2STEP1反应速度的计算：以反应消耗的H2O2mmol数表示。反应速度=加入的H2O2mmol数－剩余的H2O2mmol数即：H2O2mol浓度×加入的毫升数－KMnO40.004mol/L×消耗的KMnO4毫升数×5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）五、计算
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