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定量荧光分析教程

荧光分析的基本原理1激发当物质吸收特定波长的光子时，电子从基态跃迁到激发态。2荧光发射激发态的电子很快回到基态，并以较长波长的光子形式释放能量，这就是荧光。3斯托克斯位移荧光发射光的波长总是比激发光的波长更长，这称为斯托克斯位移。荧光量子产率

荧光光谱的特点荧光光谱是物质在受到特定波长的光激发后发射出的荧光的波长分布图，它包含了物质的重要信息，是定量荧光分析的重要依据。荧光光谱的特点主要包括：激发光谱：是指在固定发射波长下，改变激发波长，记录荧光强度随激发波长的变化曲线。激发光谱可以反映物质对不同波长光的吸收能力，有助于选择最佳激发波长。发射光谱：是指在固定激发波长下，改变发射波长，记录荧光强度随发射波长的变化曲线。发射光谱可以反映物质发出的荧光光的波长分布，有助于识别物质的种类和结构。Stokes位移：是指发射光谱的最大波长与激发光谱的最大波长之间的差值。Stokes位移的存在表明物质吸收的光能部分转化为热能，使发射光的能量低于吸收光的能量，这使得激发光和发射光可以被分别检测，避免相互干扰。荧光量子产率：是指物质吸收的光子数与发射的光子数之比。荧光量子产率反映了物质将吸收的光能转化为荧光能的效率，是定量荧光分析的重要参数。荧光寿命：是指物质处于激发态的时间。荧光寿命是物质的固有属性，可以用来识别物质的种类和结构，并与荧光量子产率相关。

影响荧光性质的因素溶剂极性溶剂的极性会影响荧光分子的电子云分布，从而改变荧光性质。例如，在极性溶剂中，荧光分子更容易发生激发态的非辐射跃迁，导致荧光强度减弱。温度温度升高会导致分子碰撞频率增加，进而促进非辐射跃迁，降低荧光强度。此外，温度变化还会影响荧光分子的量子产率和荧光寿命。pH值pH值的变化会影响荧光分子的电离状态，从而改变荧光性质。例如，一些荧光分子在酸性条件下会发生质子化，导致荧光强度增强。浓度荧光强度与荧光分子浓度呈正相关，但当浓度过高时，会发生自淬灭现象，导致荧光强度下降。

荧光强度的测量方法1直接测量法直接测量样品的荧光强度，例如使用荧光分光光度计。2间接测量法通过测量与荧光强度相关的物理量来间接测量荧光强度，例如使用荧光寿命测量仪。3相对测量法将样品的荧光强度与已知浓度的标准物质进行比较，从而获得样品的浓度信息。荧光强度的测量方法取决于实验目的和样品性质。直接测量法适用于测量样品的绝对荧光强度，间接测量法适用于测量样品的荧光寿命或量子产率，而相对测量法则适用于测量样品的浓度。

荧光检测仪器的构造荧光光源荧光检测仪器通常使用高强度光源，例如氙灯或激光器，以激发样品中的荧光物质。激发滤光片选择性地滤除光源中的特定波长，只允许激发样品所需的波长通过。样品池容纳待测样品，样品池的材质应透明且对荧光无吸收。发射滤光片滤除样品发射的除荧光以外的其他波长，只允许荧光信号通过。

荧光分光光度计的基本组成激发光源激发光源用于产生特定波长的光线，照射样品，使样品中的荧光物质产生激发。常用的激发光源包括氙灯、汞灯和激光器。氙灯和汞灯可以发出连续的光谱，而激光器则可以发出单色光。激发单色器激发单色器用于选择特定波长的激发光，照射样品。单色器通常由光栅或棱镜组成，可以将连续光谱分解成不同的波长。样品池样品池用于盛放样品，使激发光照射样品，并接收样品发出的荧光。发射单色器发射单色器用于选择特定波长的荧光，进入检测器。发射单色器的工作原理与激发单色器类似，也由光栅或棱镜组成。

单波长荧光检测激发光单波长荧光检测使用特定波长的激发光照射样品，例如紫外光或蓝光。发射光样品中的荧光物质吸收激发光，然后以更长的波长发射荧光。例如，使用紫外光激发样品，样品可能会发出蓝光或绿光。检测器荧光检测器检测特定波长的发射光，并将其转换为电信号。强度测量发射光的强度与样品中荧光物质的浓度成正比。

扫描荧光检测1激发波长扫描2发射波长扫描3同步扫描扫描荧光检测是定量荧光分析中常用的方法之一。通过改变激发波长或发射波长，可以获得荧光物质的激发光谱或发射光谱。激发波长扫描可以确定荧光物质的最大激发波长，发射波长扫描则可以确定荧光物质的最大发射波长。同步扫描则是在改变激发波长和发射波长时，保持两者之间的波长差恒定，这种方法可以减少背景荧光的干扰，提高信噪比，并可以更准确地测定荧光物质的浓度。

时间分辨荧光检测1原理时间分辨荧光检测(TRF)是一种利用荧光物质的荧光寿命差异来区分目标物质和背景荧光的方法。通过使用寿命较长的荧光探针，并延时测量荧光信号，可以有效地降低背景荧光干扰，提高检测灵敏度。2优势高灵敏度低背景噪音适用于复杂样品分析3应用TRF技术广泛应用于免疫分析、药物筛选、环境监测、食品安全等领域。例如，在免疫分析中，可以利用TRF探针标记抗体，实现对目标抗原的灵敏检测。

双荧光素同时检测