DB22T 2911-2018 贝类中副溶血性弧菌检测 微滴数字PCR法.docxVIP

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DB22

吉林省地方标准DB22/T2911—2018

贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法

DeterminationofVibrioParahemolyticusinshellfish-dropletdigitalPCRmethod

2018-11-12发布2018-12-30实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T2911—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。

本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、吉林大学中日联谊医院、吉林农业大学。

本标准主要起草人：聂丹丹、聂海英、王宁宁、杜佳剑、曲辉、彭勃、王玮琳、刘金华、罗雁非、洪晓坤。

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DB22/T2911—2018

贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和试验数据处理与防止污染措施。

本标准适用于贝类中副溶血性弧菌检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.1-2016食品安全国家标准食品卫生微生物检验总则

GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

3原理

微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据副溶血性弧菌的旋转酶（gyrase）特异性基因序列对贝类中副溶血性弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对副溶血性弧菌的快速定性检测。

4试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T668中二级水的要求。

4.1裂解液,成分包括：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100

mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl调至pH8.0。

4.2酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。4.3氯仿。

4.4异戊醇。

4.5无水乙醇。4.6异丙醇。

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4.770%乙醇。

4.82×ddPCR预混液。

4.9副溶血性弧菌旋转酶（gyrase）基因引物和探针4.10上游引物：5’-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3’

下游引物：5’-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3’

探针：5’-（FAM）-ATCCATCGTGGCGGTCATATCCAC-（TAMRA）-3’

4.11菌株：副溶血性弧菌阳性标准菌株。

5仪器和设备

5.1微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL~200μL，100μL～1000μL。

5.2高速冷冻离心机(12000r/min)。5.3涡旋混合器。

5.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.5微滴生成仪。

5.6PCR仪。

5.7微滴读数系统。

6样品

6.1样品的采集按照GB4789.1-2016中3.1的规定实施。6.2样品前处理按照GB4789.7-2013的规定执行。

7试验步骤

7.1增菌培养

按照GB4789.7-2013的规定执行