蛋白质组学及其研究方法.ppt

2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计第一相电泳：IPG－IFE平衡第二相电泳：SDS－PAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色第21页，共47页，星期日，2025年，2月5日2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。SDS-蛋白质复合物为雪茄形的长椭圆棒，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率只是蛋白质分子量的函数有关。第22页，共47页，星期日，2025年，2月5日制胶：试剂分离胶（ml）浓缩胶（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%单体3.501.0010%SDS0.100.10蒸馏水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%过硫酸铵AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01第23页，共47页，星期日，2025年，2月5日样品处理：Loadingbuffer40%甘油溴酚兰SDSβ-巯基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul样品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min第24页，共47页，星期日，2025年，2月5日电泳槽上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板第25页，共47页，星期日，2025年，2月5日第26页，共47页，星期日，2025年，2月5日蛋白质点的染色凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法,另外还采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、印度墨、35S硫脲银、胶态金、咪唑锌等.银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色,该法灵敏度为4ng,但对质谱测定有干扰,必须先脱银.考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色,该法操作方便、重现性好,同银染法一样,质谱测定时也必须先脱色.第27页，共47页，星期日，2025年，2月5日2-DE图像分析技术通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。2-DE获得的蛋白质图谱第28页，共47页，星期日，2025年，2月5日图像采集斑点检测背景消减获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较2-DE图像分析软件包操作过程：第29页，共47页，星期日，2025年，2月5日2-DE技术的优缺点优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；缺点：极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离；胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化；丙烯酰胺有神经毒作用。第30页，共47页，星期日，2025年，2月5日新型非凝胶技术液相色谱法(liquidchromatography，LC)毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)液质联用技术（LC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）多维蛋白质鉴定技术第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定传统方法：蛋白质微