DB22T 2053-2014 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光PCR方法.docxVIP

ICS07.100.30B20

备案号：41841-2014

吉林

省

地

DB22

方标准

DB22/T2053—2014

饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法

DeterminationofAspergillusnidulansinfeedstuffsReal-timePCRmethod

2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2053—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。

T

DB22/T2053—2014

饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法

1范围

本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13092饲料中霉菌总数的测定

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR

实时荧光聚合酶链式反应。3.2

Ct值cyclethresholdvalue

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

对样品的培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中的构巢曲霉进行快速检测。

5试剂

除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

5.1引物及探针：

a)上游引物：5’-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’

b)下游引物：5’-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’

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DB22/T2053—2014

c)探针：5-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3’

5.2TaqDNA聚合酶。

5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinatriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidine

triphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。

5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KCl),15mmol/L氯

化镁(MgCl?)。

5.6高盐察氏培养基：按GB/T13092规定。

5.7构巢曲霉质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。

6仪器和设备

6.1实时荧光PCR仪。

6.2生物安全柜：AII型。

6.3霉菌培养箱。

6.4离心机：转速≥12000r/min。

6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.6高压灭菌器。

6.7恒温水浴锅。

6.8天平：感量0.1g。

6.9移液器：0.2μL～2μL、2μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。

6.10均质器或乳钵。

6.11涡旋混合器

6.12实时荧光PCR反应管。

6.13离心管：1.5mL。

7检测步骤

7.1样品制备与培养

参照GB/T13092对样品进行制备与培养。

7.2DNA提取

7.2.1DNA模板制备

从培养平皿上刮取菌丝0.2g~0.5g于1.5mL离心管，使用真菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。

7.2.2DNA浓度测定

取10μLDNA溶液加蒸