蛋白质分离纯化与表征.ppt

（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH不同蛋白在各自pI处依次沉淀2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介电常数和温度。4.温度对蛋白质溶剂度的影响第30页，共43页，星期日，2025年，2月5日（三)根据电荷不同的分离方法1.电泳原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日平板电泳第32页，共43页，星期日，2025年，2月5日扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程扬州大学生物科学与技术学院关于蛋白质分离纯化与表征第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质分离纯化是利用其特性的差异分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异生物学亲和力蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白质的酸碱性质第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白质分子的大小与形状第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日测定蛋白质相对分子质量的原理和方法（一）根据化学组成测定最低相对分子质量（二）渗透压法测定相对分子质量（三）蛋白质的扩散和扩散系数（四）沉降分析法测定相对分子质量（五）凝胶过滤法测定相对分子质量（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对分子质量就是55.8/0.335×100=16700第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日（五）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不取决于分子的质量，而是它的斯托克半价。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同，则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质混合样标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键第11页，共43页，星期日，2025年，2月5日第12页，共43页，星期日，2025年，2月5日第13页，共43页，星期日，2025年，2月5日第14页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质分子的形状蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比，也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。第15页，共43页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液第16页，共43页，星期日，2025年，2月5日蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性3.质点的大小（1～100nm）蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质第17页，共43页，星期日，2025年，2月5日（二）蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀I可逆沉淀温和条件，改变溶液pH或Pr所带电