酶的分离纯化.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理。蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物。不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。第95页，共120页，星期日，2025年，2月5日1.变性的本质蛋白质变性作用的实质仅仅破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。第96页，共120页，星期日，2025年，2月5日SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。但为了消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用孔径的不同引起的分子筛效应将蛋白质分开。也可在整个电泳体系中加入SDS（十二烷基硫酸钠sodiumdodecylsulfate），则电泳的迁移率主要依赖于分子量，这种方法称为SDS，分为连续的和不连续的两种。第97页，共120页，星期日，2025年，2月5日（3）SDS－PAGE电泳检测分子量1、分离胶：10％、12％，主要起分子筛作用。2、压缩胶：相同。作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，提高分离效果。3、在蛋白质样品加1%SDS和1%的巯基乙醇，100℃水浴3分钟，凝胶中加入SDS。4、点样：样品与溴酚蓝染料混合，15～18ul。5、电泳缓冲液：加SDS。6、电泳：开始电流为15mA，然后30mA电泳，当染料距底部1.5cm时，停止电泳。第98页，共120页，星期日，2025年，2月5日3、硫酸铵盐析的实验结果（1）最佳盐析硫酸铵的用量与发酵液的量和酶蛋白的单位浓度有关。（2）当发酵液为26U／ml左右时，发酵液300毫升盐析结果为如下：(3)当发酵液为30U／ml左右时，发酵液600毫升盐析结果为如下：第63页，共120页，星期日，2025年，2月5日第64页，共120页，星期日，2025年，2月5日第65页，共120页，星期日，2025年，2月5日第66页，共120页，星期日，2025年，2月5日进行菌株的复壮工作分离单菌落挑大的、中等大小菌落在平板上作水解圈实验第67页，共120页，星期日，2025年，2月5日2、盐析酶液的透析及浓缩1.盐析酶液的透析：采用孔径为2万的透析袋，将酶液装入透析袋中，用与柱洗脱液相同液体透析，一般要换透析液6～8次，可见酶液的色素明显变淡。2.浓缩：采用分子量为2万的聚乙二醇（PEG），将透析好的酶液放入烧杯中，直接将透析袋放入，倒入PEG入烧杯盖在透析袋上，常常观察，根据样品的量及需要浓缩的倍数决定时间，一般3～5小时即可。第68页，共120页，星期日，2025年，2月5日4、色谱的分离研究1、离子交换层析（DEAESephadexA-25）2、葡聚糖琼脂凝胶层析柱3、酶蛋白分子量的测定（SDS－PAGE）第69页，共120页，星期日，2025年，2月5日（1）DEAESephadexA-25层析1、DEAESephadexA-25凝胶的分离范围：30000～200000。2、DEAESephadexA-25凝胶的溶胀方法：溶胀度为5～9，先用蒸馏水浸泡，除去细小的颗粒，再采用15倍（50克加蒸馏水750ml）蒸馏水水浴煮沸2～3小时，关键点要轻搅拌，在浸泡24小时充分溶胀，同时换几次蒸馏水除去细小颗粒备处理。3、用4倍2mol/LHCL搅拌4小时，水洗至中性，再用2mol/LNaOH搅拌，水洗至中性。第70页，共120页，星期日，2025年，2月5日DEAESephadexA-25(50)层析原理离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的高分子固态化合物，它的化学稳定性良好，且具有离子交换能力。离子交换树脂是多孔的、疏松的海绵样的结构。高分子树脂骨架，不能移动离子交换树脂可以移动的活性离子（阳离子、阴离子），在树脂骨架中可以进进出出，就发生交换现象。第71页，共120页，星期日，2025年，2月5日★第72页，共120页，星期日，2025年，2月5日离子交换原理：不是单一的吸附作用，包括复杂的