酶联免疫吸附试验.ppt

固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE3.原理第31页，共73页，星期日，2025年，2月5日4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体（+）YYY3.加酶标二抗洗涤YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不显色2.加待检物（无抗体）洗涤1.已知抗原包被载体（-）3.加酶标二抗洗涤YEYEYE洗涤洗涤4.操作步骤第32页，共73页，星期日，2025年，2月5日（五）双抗原夹心法检测抗体用同一种抗原分别作为酶标抗原和固相抗原以检测抗体的方法用于抗体的检测1．原理2．应用第33页，共73页，星期日，2025年，2月5日E固相抗体标本（含抗体）酶标抗原底物EE3.原理第34页，共73页，星期日，2025年，2月5日4.加酶作用的底物不显色（+）（-）4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体3.加酶标抗原洗涤YEYYYYEYEYEYEYE2.加待检物（无抗体）洗涤1.已知抗原包被载体3.加酶标抗原洗涤EEE洗涤洗涤4.操作步骤第35页，共73页，星期日，2025年，2月5日（六）竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。1．原理第36页，共73页，星期日，2025年，2月5日（1）竞争法检测HBcAb：①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。2．技术要点第37页，共73页，星期日，2025年，2月5日固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测HBcAb第38页，共73页，星期日，2025年，2月5日（2）竞争法检测HBeAb：①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。第39页，共73页，星期日，2025年，2月5日固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测HBeAb第40页，共73页，星期日，2025年，2月5日（七）捕获法1.概念先用固相化的抗人IgM抗体捕获IgM，再用特异性抗原及其酶标抗体检测相应的IgM2.应用血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法第41页，共73页，星期日，2025年，2月5日3.原理

第42页，共73页，星期日，2025年，2月5日采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。4．注意事项第43页，共73页，星期日，2025年，2月5日非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。第44页，共73页，星期日，2025年，2月5日三、技术要点（一）常用的固相载体1.聚苯乙烯——目前最常使用（1）蛋白质吸附性能较强，保留免疫活性，价格低廉，不参与化学反应。第45页，共73页，星期日，2025年，2月5日（2）形状小试管、小珠和微量反应板。最常使用的载体是微量反应板，也称为ELISA板。国际通用标准板形是8×12的96孔板，也有8×6的48孔板。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。第46页，共73页，星期日，2025年，2月5日微量反应板返回章目录第47页，共73页，星期日，2025年，2月5日2.聚氯乙烯与聚苯乙烯类似，特点为质软板薄，可切割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。3.微孔滤膜如硝酸纤维素膜、尼龙膜等。4.含铁的磁性微粒第48页，共73页，星期日，2025年，2月5日四、测定方法（一）加样加液体ELISA中一般需进行1次加样和4-5次加液。在定性测定中虽