受体卵母细胞的准备超数排卵周龄的昆明白小鼠雌性.pptx

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法1.受体卵母细胞的准备（1）超数排卵4周龄的昆明白小鼠，雌性，10IU的注射用孕马血清促性腺激素（PMSG）腹腔给药，48h后腹腔注射10IU的注射用绒毛膜促性腺激素（HCG）。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法昆明白小鼠孕马血清促性腺激素（PMSG）绒促性素（HCG）

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵15h后，小鼠吸入二氧化碳颈椎脱臼安乐死。将安乐死后的小鼠腹部向上平躺，70％医用酒精喷洒于小鼠腹部消毒，尽量减少污染。使用眼科镊夹起小鼠腹部腹中线附近的皮毛，并尽量提起，眼科剪在腹腔中间部位剪一小口，眼科剪换成另一把眼科镊，两头同时用力向相反方向撕拉小鼠皮肤，使腹腔完全暴露。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵用眼科剪和眼科镊打开腹腔壁，在肾的附近用镊子夹住子宫角的上部，将脂肪垫、子宫、输卵管、卵巢一起拉出腹腔。眼科镊夹住卵巢轻轻提起，眼科剪在靠近输卵管的子宫系膜上开一口，将子宫、输卵管及卵巢与子宫系膜分离。将卵巢与输卵管分离，输卵管下方子宫体1cm处剪断，剪下部分放入培养皿中（放有预热好的杜氏磷酸盐缓冲液D-PBS）。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵将输卵管和带着的部分子宫转移入另一放有预热好D-PBS的培养皿，在体视显微镜下用眼科镊固定两端，26号注射针头或者另一把眼科镊撕破输卵管壶腹部，释放出卵丘卵母细胞团。如细胞团不能自己释放，用镊子轻轻地把它们挤出壶腹部。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法倒置显微镜

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法输卵管里的卵泡卵丘细胞-卵母细胞

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵将所有卵丘卵母细胞团用移液枪移入预热好的透明质酸酶中，用200μl的枪头来回吹打1~2min或者吹打80~100下，得到MⅡ卵母细胞。用吸卵针收集的卵母细胞和转移到KSOM培养液，洗三次以除去残留的透明质酸酶，卵丘细胞和杂质。然后将卵母细胞转移到平衡好的微滴培养皿中（微滴培养皿中的培养液需要在37℃、5%CO2培养箱中平衡至少4h以上），放入CO2培养箱中培养30min左右。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法移液枪微滴培养皿

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备（1）卵丘细胞制备1）收集卵细胞时，透明质酸酶消化后可以将卵丘细胞与卵细胞分离开。2）将卵细胞挑选出之后，将剩余的卵丘细胞用口吸管挑出来，用HCZB洗两遍。3）将卵丘细胞放入到带有HCZB的EP管中，1000rpm，4℃离心机离心5分钟。去除上清，用3%的PVP溶液重悬，放到冰上保存备用。离心管（Eppendorf管）

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备：（2）HCZBH-CZB卵操作液配制：100mLCZB中加入0.4776gHepes和0.042gNaHC03及0.01gBSA。HEPES一种非离子两性缓冲液,其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。BSA牛血清白蛋白

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备：（2）HCZB

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射1）准备操作滴：用含５mg/mLCB的HCZB制作去核、注核操作滴，分别做3%PVP和10%PVP液滴作为洗针液，上层用矿物油覆盖，放于37℃温台上预热。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射２）选择透明带界限清晰、没有分裂碎片的卵细施，用口吸管放到操作滴中。３）先用持卵针固定住卵母细胞，调整卵细胞的位置，使纺锤体位于３点钟的位置，用去核针将纺锤体吸出。去核的卵细胞静置一段时间后转移到CZB培养基中保存备用。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射４）将前面准备好的卵丘细胞用口吸管转移到3%的PVP液滴中，挑选生长状况良好的细胞，用注核针将细胞反复的吸进和退出，使细胞核暴露出来，然后将细胞核注射到去核的卵细胞中，重组好的胚胎转移到CZB培养液中放置30分钟以上。

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