细胞基因组DNA的提取.pptVIP

细胞基因组DNA的提取银巍中山医学院生化教研室实验一细胞基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则一、实验原理核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。3、核酸制备的一般原则一、实验原理提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸制备的步骤：破碎细胞核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理低温操作在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPCDNase01RNase02蛋白酶K03溶菌酶04核酸制备中常用的酶破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂核酸提取的一般过程首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去破碎抽提核酸除去杂质核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0实验目的材料与试剂实验操作与注意事项,1000rpm,5min离心01最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融02提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）03组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA