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基因敲除与功能研究：从理论到实践;课程目标与学习内容;基因敲除的基本概念;基因敲除技术发展历史;基因敲除的重要性和应用领域;基因敲除与传统基因研究方法的比较;基因敲除的基本原理;同源重组的分子机制;DNA双链断裂修复机制;基因靶向的关键要素;载体设计的基本要求;常用的基因敲除载体类型;正负选择标记基因的选择;同源臂的设计原则;PCR扩增同源臂的注意事项;载体构建的具体步骤;质粒提取和纯化方法;细胞转染技术概述;常用转染方法的比较;电转法的原理和操作要点;脂质体转染的优化策略;病毒转导系统的应用;转染效率的评估方法;抗性筛选的原理和方法;PCR验证策略;Southern杂交验证;测序验证的重要性;多重PCR验证体系;基因敲除细胞系的建立;单克隆细胞的筛选方法;克隆细胞的扩增培养;敲除细胞的保存技术;CRISPR/Cas9系统简介;sgRNA的设计原则;Cas9蛋白的作用机制;PAM序列的重要性;脱靶效应的评估;基因敲除效率的优化;多基因同时敲除策略;条件性基因敲除系统;Cre-LoxP系统的应用;诱导性基因敲除技术;组织特异性基因敲除;基因敲除小鼠模型构建;胚胎干细胞的培养技术;嵌合体小鼠的产生;种系传递的筛选;基因型鉴定方法;表型分析策略;行为学测试方法;生理指标检测;分子水平功能分析;转录组测序分析;蛋白质组学研究;代谢组学分析;表观遗传学研究;信号通路分析;细胞周期研究;细胞凋亡分析;典型案例分析
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