质粒的酶切-琼脂糖凝胶电泳分离DNA.pptVIP

实验二质粒的酶切、琼脂糖凝

胶电泳分离DNA实验目的01实验原理02实验仪器、材料与试剂03实验步骤04实验结果及讨论0501限制性内切酶切割出目的DNA02了解琼脂糖凝胶电泳的原理03掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法实验目的01利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。02琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA），且检测的范围很广。实验原理pBCSKmap它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。水平式凝胶电泳槽稳压电泳仪电炉紫外检测仪台式离心机实验仪器、材料与试剂仪器材料实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。（三）试剂1.限制性内切酶EcoRI，2.TAE电泳缓冲液(50×)（pH8.0）Tris242g冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml3.溴化乙锭溶液10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。4.10×DNA样品上样缓冲液5.琼脂糖实验步骤酶切体系调制酶切体系如下:(共20μL)无菌水6μL，质粒10μLBufferK2μL,EcoRI1μL,BamHI1μL37℃酶切1.5小时。1洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。2插好挡板、梳子。3根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1×TAE）。4加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。5溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4μL(终浓度为0.1g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。琼脂糖凝胶制备室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。01加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。02在DNA样品中加入2μL(1/10体积)的10×DNA上样缓冲液(loadingbuffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。03用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。041插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。2等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。3取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。4.根据需要切下DNA条带，放入1.5mlEp管中，放于4℃保存，以备下周实验用。