胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术.ppt

关于胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术第1页，共26页，星期日，2025年，2月5日概述概念胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。意义是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之一。是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。第2页，共26页，星期日，2025年，2月5日历史回顾冷冻原理冷冻方法卵母细胞冷冻保存胚胎冷冻保存解冻方法冷冻效果鉴定影响冷冻效果的因素存在问题及展望第3页，共26页，星期日，2025年，2月5日历史回顾1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎。1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细胞得到活仔。1977年Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。第4页，共26页，星期日，2025年，2月5日冷冻原理低温冷冻保存的细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，细胞内所有化学变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存。低温保存的细胞以一定方式复苏后，又具有存活能力。细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50~-15℃）第5页，共26页，星期日，2025年，2月5日一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生两种情况：（1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。（2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。第6页，共26页，星期日，2025年，2月5日在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温度瞬间剧增，造成过冷损伤。冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳定性而导致染色体异常。第7页，共26页，星期日，2025年，2月5日二、保护措施诱发结晶溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。第8页，共26页，星期日，2025年，2月5日使用冷冻保护剂冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后，整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。渗透性保护剂渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：①防止细胞因脱水过度收缩；②与水分子发生水合作用，减慢溶液结晶速度；③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减少盐害作用的产生。第9页，共26页，星期日，2025年，2月5日非渗透性保护剂这是一类大分子化合物，能溶于水，但不能渗入细胞，较为常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。在快速冷冻时，可协助渗透性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液