DB34_T 4198-2022 梨黑斑病菌的LAMP检测方法.docxVIP

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安徽省地方标准

DB34/T4198—2022

梨黑斑病菌的LAMP检测方法

DetectionofAlternariaspeciesinvolvedinpearblackspotusingLAMP

2022-06-29发布2022-07-29实施

安徽省市场监督管理局发布

I

DB34/T4198—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。

本文件由安徽省农业农村厅归口。

本文件起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、巢湖市农机管理中心、安徽省农业科学院园艺研究所、怀远县农业技术推广中心。

本文件主要起草人：杨雪、谷春艳、潘锐、翟承勋、徐会永、臧昊昱、戚仁德、高正辉、齐永杰、王同岁。

DB34/T4198—2022

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梨黑斑病菌的LAMP检测方法

1范围

本文件规定了梨黑斑病菌的LAMP检测方法。

本文件适用于梨黑斑病菌检测的组织和人员。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

梨黑斑病pearblackspot

由链格孢类（Alternariaspp.）真菌引起的一种重要病害，已报道病原菌主要包括AlternariagaisenK.Nagan、A.alternata(Fr.)Keissler、A.tenuissima(Fr.)Wiltsh、A.infectoria、

A.yaliinficiensR.G.Roberts和A.ventricosaR.G.Roberts。

4方法原理

根据梨黑斑病病原菌的cytb序列设计的特异性引物进行LAMP（Loop-mediatedisothermalamplification,环介导等温扩增技术）检测作为判断梨黑斑病菌的依据。

5仪器设备

5.1高速离心机：转速≤15000r/min

5.2涡旋振荡器

5.3恒温金属浴

5.4光照培养箱：20℃~30℃

5.5超低温冰箱：-80℃

5.6电泳仪

5.7凝胶成像仪

5.8可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL

6试剂和培养基

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DB34/T4198—2022

6.1培养基

WA培养基（琼脂粉20g，加水1000mL），PDA培养基（去皮马铃薯200g，蔗糖（或葡萄糖）

20g，琼脂粉20g，加水补足至1000mL）。

6.2DNA提取试剂

2％CTAB提取液（100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2％(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇（用时加入）），无水乙醇，10％SDS，酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，氯仿，异丙醇，TE（10mmol/LTris-HCL(pH8.0)，1mmol/LEDTA）。

6.3LAMP检测试剂

BstDNA聚合酶，甜菜碱（Betaine），显色剂SYBRGreenI，TAE电泳缓冲液(Tris4.84g，Na2EDTA·2H200.75g，冰乙酸1.142mL，加水至1000mL，pH8.5)，琼脂糖。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中三级水的标准。

7检测方法

7.1病原菌分离与纯化

将梨病果用75％乙醇表面消毒30s后，于病健交界处取少量组织置于WA培养基中28℃培养。待长出菌丝后，切取一小块放在PDA培养基中于培养7d左右，收集菌丝于4℃备用。

7.2供试DNA提取

7.2.1CTAB法：取少量菌丝粉，加入900μL2％CTAB提取液