过表达及敲除细胞系建立及所需材料详细.pptVIP

1.获取cDNA:(1)厦门大学韩家淮实验室免费提供：，先在NCBI或是其它权威网站上找到你所想要的基因的序列信息，再去上述网址找到他们所提供的序列信息，比对两者之间有无差异，如果完全相同即可立刻用交大邮箱免费申请（快递费用需自付）。如果找不到你所需要的基因序列，或是该实验室提供的序列与你需要的序列不相符，则只能通过其它方法获得。(2)收集你所需要的基因表达丰度较高的细胞，抽取RNA后利用随机引物反转成cDNA供使用。2.设计引物或是敲除片段：（1）如无特殊需求，引物设计遵从：保护碱基（4）+酶切位点（6）+基因序列正向前20个碱基/反向后20个碱基（反向后20个碱基需转换为反向互补碱基），如需要从CDS序列以外设计引物，则视具体情况不同而定。（2）根据所选用载体上可供选择位点做参考选择酶切位点，需要注意的是你的目的片段中不能够含有与酶切位点相同的序列，如果有，则需要更换不同的酶切位点，否则实验过程中会导致目的片段的剪切从而无法得到所想要的质粒。（3）敲除片段的选择需要利用设计网站如clontech，life-technologies等网站。所有引物设计好后发由公司合成，如生工等，周期约3天左右。3.构建过程（1）PCR-聚合酶链反应—利用获取的cDNA(菌液或是抽提出其中质粒均可)作为模板，加入引物，利用扩增酶进行聚合酶链反应，对目的片段进行扩增，扩增之后利用琼脂糖凝胶电泳及DNAmarker确定条带位置是否正确。最后切胶，利用胶回收试剂盒进行回收，提取凝胶中的目的条带DNA。（2）酶切—利用与引物设计时的酶切位点一致的限制性内切酶，切割回收的目Step1:plasmidconstruction:10-18days的片段DNA以及载体质粒，使两者暴露黏性末端，为下一步连接做准备。酶切完全后（一般至少3小时，最好过夜），同样利用凝胶电泳观察条带是否被完全切开，载体跑胶时需加一道未切割的载体做对照以确定是否被酶切完全（质粒为闭合环状、开环或是线性时跑出来条带的大小各不相同，且容易区分），之后选择正确的位置，切胶，胶回收。（3）连接—利用T4连接酶将酶切好的载体与目的片段进行连接，室温3小时。（4）转化—将连接好的体系利用热激原理转入细菌感受态中，并通过37度摇床小摇45min活化感受态，最后铺板，37度过夜（12-14小时）。（5）小摇—挑取单克隆至3ml带抗性的LB中，37度摇床小摇8-12小时。（6）PCR验证—利用之前扩增时的相同引物对小摇的菌液sample进行PCR验证，同时带上模板菌液或是质粒作为阳性对照，并跑胶观察条带进行鉴定。（7）测序—选取3-5个PCR阳性样品送测序公司进行测序，先测正向反应，等待结果反馈对比后选取正向完全正确及图谱峰值稳定的sample再进行反向测序，最后选取测序比对完全正确的sample（存在无意义点突变的sample也可选择）。（8）扩增—大摇、大抽：取正确的sample菌液至100-150ml的含抗LB中，37度摇床大摇12-14小时，收集菌液利用大抽试剂盒进行大抽（约需要4-6小时）（9）跑胶验证条带并利用Nanojob进行核酸定量。（10）抽提出质量及浓度合格的质粒即可以进行后续实验，注意去除内毒素及保证无菌操作。1mlLB配方：Nacl：5g，Tryptone：10g，YeastExtract：10g，配好后分装至锥形瓶中，包好瓶口，高压。LB平板：1mlLB+10gagar,高压后稍作冷却至手温立即加入抗生素并迅速倒板，倒好后将板子密封4度保存。抗生素配方：氨苄：100mg/ml，1:1000使用，高压无菌水配置后分装成1ml/支，-20度保存。10×Pfu扩增酶（LIFENG）；内切酶（NEB）；胶回收试剂盒、大抽试剂盒（MN）；小抽试剂盒（生工）；感受态（TIANGEN）；DNAmarker、T4ligase（takara）；Pbabe-3flag、PSIREN载体。250bp1000bp2500bp5000bp15000bp10000bp7500bpmarkerPbabe-3flagPSIRENGag-polVSV-GANXA-1切后切前切后切前切后Pbabe-3flagPSIREN?上样量少或是载体放置时间过长质粒鉴定酶切鉴定阳性对照Sample1Sample2Sample3Sample4Sample5Sample6Sample7Sample8PCR验证＋＋＋－－＋－－＋?在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种