抗肿瘤药物筛选.ppt

抗肿瘤药物筛选;一细胞筛选;筛选措施

1.四氮唑蓝（MTT）还原法

原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值;应用：用于某些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

特点：敏捷度高、经济。

缺陷：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。;环节：

（1）制备单细胞悬液；

(2)对细胞进行计数，计数后接种于96孔板，一般每孔细胞数为5000个（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）；

（3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养；

（4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不一样浓度药物，继续培养；

（5）24或48h后来，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀；

（6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。;;;CCK-8法;2.集落形成法：

测定单个细胞的增殖能力

原理：单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后裔所构成的细胞群体，称克隆或集落。一般50个以上细胞，通过计数克隆形成率，定量分析单个细胞的增殖能力。

用途：抗癌药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验

常用措施：平板克隆形成试验，软琼脂克隆形成试验

注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。;3.台盼蓝排斥试验

原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。

活细胞总数×100

活细胞率（％）＝

活细胞总数＋死细胞总数

注意：简朴，最常用。染色时间不适宜过长。

特点：悬浮细胞较以便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。;二微生物学筛选措施

(抗肿瘤抗生素);1.噬菌体法

噬菌体：是一类能感染微生物的病毒;（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能克制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体的现象。

（2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，尚有一种噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。不过当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而减少时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。某些抗肿瘤抗生素有诱导能力。;2.细菌变种法

(1)人工培育变种

如:使细菌模仿肿瘤细胞的某些代谢特点

使细菌对核酸或蛋白合成克制剂敏感

(2)检测突变作用

如:依赖链霉素的菌株;3.抗代谢法

;三精原细胞法

(抗生素和植物药)

1.建立根据

B型精原细胞具有高度敏感性

2.试验措施及鉴定

22－28g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不一样浓度，每一浓度用2－3只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，显微镜观测。;四运用分子靶点筛选

1.克制血管生成的筛选模型

体外：血管内皮细胞培养

体内：动物眼角膜囊

地鼠颊囊

裸鼠外耳皮下

鸡胚绒毛尿囊膜;鸡胚绒毛尿囊膜模型;;对照组;;操作环节：

（1）于试验前72h孵育受精蛋

（2）试验进行前以照蛋箱透照孵育的种蛋，凡已正常发育的种蛋可照见胚胎的影子，用铅笔做记号，弃取未发育种蛋

（3）用碘酒、酒精消毒蛋壳。敲碎蛋壳把鸡胚移入平皿中，加入EagleFs培养液5-10ml，然后，可选择在鸡胚尿囊膜血管网的任何位置放置小块明胶海绵作为筛选抗血管生成药物的载体，然后加入不一样浓度的血管生成克制剂。

（4）于加药后24h、48h和72h分别在显微镜下观测药物作用成果，并摄影。

（5）血管计数。可结合自动图像分析系统、摄像等技术完毕

血管生成克制率＝（对照组血管面积－药物组血管面积）/对照组血管面积×100％;2.以端粒酶为靶点的药物筛选

端粒：真核细胞染色体末端的特殊构造。功能是维持染色体稳定性。，防止染色体DNA降解，保护染色体构造基因，调整正常细胞生长。

“生命的时钟”“有丝分裂的计数器”

端粒酶功能：通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒的长度。

端粒酶活性测定措施

端粒酶克制剂;3.细胞凋亡通路靶点;细胞周期调控靶点

与侵袭有关的靶点

耐药有关的分子靶点

靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、个性化;五动物模型

整体动物试验法是评价一种药物与否有效的最重要措施

整体动物在肿瘤药理学研究中的作用