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EGFR抑制剂YS-363的抗肿瘤作用研究

一、引言

表皮生长因子受体（EGFR）在多种肿瘤细胞的增殖、存活、迁移和血管生成中发挥关键作用。EGFR的异常激活常与肿瘤的发生、发展及不良预后相关。开发有效的EGFR抑制剂成为肿瘤治疗的重要策略之一。YS-363作为一种新型的EGFR抑制剂，其抗肿瘤作用有待深入探究。本研究旨在评估YS-363对肿瘤细胞的生长抑制、诱导凋亡及相关分子机制，为其临床应用提供理论依据。

二、材料与方法

（一）细胞系与试剂

选用人非小细胞肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人结肠癌细胞系HT-29。YS-363由[研发公司名称]提供，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自[供应商名称]。CCK-8试剂盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Westernblot相关抗体均购自知名生物试剂公司。

（二）细胞培养

将A549、MDA-MB-231和HT-29细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞融合度达80%-90%时进行传代或实验。

（三）CCK-8法检测细胞增殖

将对数生长期的细胞以5×103个/孔接种于96孔板，培养24h后，加入不同浓度（0、0.1、1、10、100μmol/L）的YS-363，每组设6个复孔。继续培养24、48和72h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育2h，用酶标仪在450nm波长处检测吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

（四）AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

将细胞以1×10?个/孔接种于6孔板，培养24h后，加入10μmol/LYS-363处理48h。收集细胞，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，分析早期凋亡和晚期凋亡细胞比例。

（五）Westernblot检测相关蛋白表达

细胞经YS-363处理后，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，分别加入EGFR、p-EGFR、Bax、Bcl-2、Caspase-3等抗体4℃孵育过夜，次日加入相应二抗室温孵育1h，ECL化学发光法显影，用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

三、结果

（一）YS-363对肿瘤细胞增殖的抑制作用

CCK-8结果显示，YS-363对A549、MDA-MB-231和HT-29细胞的增殖均有显著抑制作用，且呈浓度和时间依赖性（图1）。在72h时，YS-363对A549细胞的IC??值为（5.6±0.8）μmol/L，对MDA-MB-231细胞的IC??值为（7.2±1.0）μmol/L，对HT-29细胞的IC??值为（8.5±1.2）μmol/L。

[此处插入图1：YS-363对不同肿瘤细胞增殖的抑制曲线]

（二）YS-363诱导肿瘤细胞凋亡

流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，10μmol/LYS-363处理48h后，A549、MDA-MB-231和HT-29细胞的凋亡率显著增加（图2）。其中，A549细胞的早期凋亡率从对照组的（3.2±0.5）%增加至（18.6±1.5）%，晚期凋亡率从（2.1±0.3）%增加至（10.2±1.0）%；MDA-MB-231细胞的早期凋亡率从（4.1±0.6）%增加至（20.5±1.8）%，晚期凋亡率从（2.5±0.4）%增加至（12.3±1.2）%；HT-29细胞的早期凋亡率从（3.8±0.5）%增加至（19.3±1.6）%，晚期凋亡率从（2.3±0.3）%增加至（11.5±1.1）%。

[此处插入图2：YS-363诱导不同肿瘤细胞凋亡的流式细胞术检测结果]

（三）YS-363对相关蛋白表达的影响

Westernblot结果显示，YS-363处理后，三种肿瘤细胞中EGFR和p-EGFR的表达均显著降低（图3）。同时，促凋