浮萍棘尾虫多胺生物合成途径的研究.pdf

中文摘要

多胺是一类含有两个或多个氨基的脂肪族多聚阳离子化合物，在调节细胞

生长和维系细胞生存方面发挥着重要作用。多胺的种类有很多，常见的有精胺、

亚精胺以及腐胺。在不同的生物体中多胺生物合成途径表现出丰富的多样性。

植物和动物细胞中拥有较为完整的多胺生物合成途径，而一些纤毛虫中多胺生

物合成途径并不完整。本研究针对浮萍棘尾虫（Stylonychialemnae）的多胺生

物合成途径展开研究，通过生物信息学的方法在浮萍棘尾虫大核基因组数据库

中鉴定到3个与多胺合成相关的脱羧酶基因；构建重组质粒，在大肠杆菌中进

行重组蛋白的表达纯化，通过高效液相色谱法鉴定其功能；同时也通过高效液

相色谱法检测到浮萍棘尾虫胞内多胺的种类和含量。具体实验结果如下：

1.浮萍棘尾虫多胺生物合成途径相关基因的鉴定

通过Blast比对在浮萍棘尾虫大核基因组数据库中鉴定到3个多胺合成相关

3//sl-

的基因，结果表明这个基因是精氨酸鸟氨酸赖氨酸脱羧酶，分别命名为

LAOdc-1、sl-LAOdc-2、sl-LAOdc-3。系统发育分析表明他们与细菌的精氨酸脱

羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及赖氨酸脱羧酶聚为一枝。进一步序列分析发现，sl-

LAOdc-3含有读框内终止密码子，单细胞PCR扩增该基因后进行测序，确认该

多框内终止密码子真实存在，推测该基因为假基因。通过同源建模，预测sl-

LAOdc-1和sl-LAOdc-2蛋白的三维结构，预测结果表明两个蛋白三维结构相似，

为二聚体结构，含有AAT-Fold结构域。

2.浮萍棘尾虫sl-LAOdc的表达、纯化及特征分析

通过基因合成、IPTG诱导和镍柱亲和层析得到目的蛋白sl-LAOdc-1和sl-

LAOdc-2sl-LAOdc-1sl-

。对得到的目的蛋白进行性质和酶功能的分析。将和

LAOdc-2分别与底物赖氨酸、鸟氨酸进行反应，高效液相色谱法检测反应产物

中的多胺类型。高效液相色谱结果显示sl-LAOdc-1脱羧酶能够催化赖氨酸生成

尸胺，催化鸟氨酸生成腐胺，因此可以确定sl-LAOdc-1是赖氨酸鸟氨酸双功/

能脱羧酶。高效液相色谱结果显示sl-LAOdc-2并没有脱羧酶活性。

I

进一步对sl-LAOdc-1的酶学性质进行分析，实验结果表明，当以赖氨酸为

底物时sl-LAOdc-1最适pH为7.0，最适温度为45℃，K值为2.647

m

mmol/L，V为77.0286µmol/min。当以鸟氨酸为底物时sl-LAOdc-1最适

max

pH6.545K1.2165mmol/LV30.7164

为，最适温度为℃，值为，为

mmax

µmol/min。

3.sl-LAOdc-1的功能探究

为了探究sl-LAOdc-1在浮萍棘尾虫胞内发挥的作用，我们利用10µmol/L，

50µmol/L，100µmol/L浓度的二氟甲基鸟氨酸（Difluoromethylornithine，DFMO）

处理浮萍棘尾虫，发现DFMO并没有对浮萍棘尾虫的生长起到抑制作用。构建

L4440-sl-LAOdc-1-1L4440-sl-LAOdc-1-2RNA

重组质粒和，利用干扰技术敲减

sl-L