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病毒检测

酶联免疫吸附测定（ELISA）胶体金免疫层析技术（GICA）梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)

ELISA基本原理?使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。?使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。?样品和酶结合物与固相载体上抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物，洗涤去除未结合物，加入底物，根据底物显色程度来判定免疫反应是否存在及待测物质含量。包被、封闭

聚苯乙烯聚氯乙烯硝酸纤维素膜玻璃纤维素膜尼龙膜塑料制品微粒膜载体固相载体合微球或颗粒高分子单体聚

包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。封闭：用1%~5%的牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，消除由于加入血清和酶结合物中蛋白质部分吸附于固相载体表面产生非特异性显色的干扰，此过程称为封闭。

牛血清白蛋白固相载体包被抗体

ELISA的酶应符合以下要求：纯度高；催化反应的转化率高；专一性强；性质稳定；来源丰富；价格低廉；制备成酶结合物后仍继续保留活性和催化能力；在受检标本中不存在相同的酶；相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定。

乙酰胆碱酯酶辣根过氧化物酶HRP碱性磷酸酶APβ-D-半乳糖苷酶葡萄糖氧化酶ELISA常用酶

HRP来源组成主酶辅基无色糖蛋白275nm亚铁血红素403nm酶活性基团纯度：RZ=A403/A275ELISA:RZ3.0

酶结合物组成成分酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。抗原和抗体抗体：特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产、易于分离纯化。常用纯度较高的IgG。抗原：模式不多，要求纯度高，抗原性完整。

酶结合物的制备戊二醛交联法：ELISA中常用的酶一般都用此法交联。一步法：戊二醛直接加入酶与抗体的混合物1.酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛，再与抗体作用而形成酶标抗体。两步法：2.抗体与戊二醛作用，再与酶联结。过碘酸盐氧化法：用于含糖量较高的酶。HRP的标记常用此法。方法：过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。方法

底物选择未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化；所显色易于洗脱；显色后的产物要求稳定；价廉，易得而且无毒。

AP：硝基苯磷酸盐，桔黄色，NaOH终止反应403nm测定OD值。过去：5-氨基水杨酸棕色HRP1.邻苯二胺（OPD）桔黄色H2SO4/柠檬酸棕黄色492nm现在2.邻联甲苯胺（OT）蓝色不需终止630nm加终止剂黄色405nm3.3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）蓝色NaN3/SDS黄色450nm

ELISA温育常用温度43℃、37℃、室温、4℃。37℃是实验室常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。抗原抗体反应在37℃下经过1-2h，产物生成可达顶峰。有些试验43℃可加速反应，但不宜采用更高温度。4℃抗原抗体反应更为彻底，但所需时间长，一般不采用。

ELISA常用方法（一）测抗原1.竞争法:小分子半抗原（药物、激素等）

2.双抗体夹心法:HBsAg

3.抑制性测定法

（二）测抗体1.间接法：HCV、HIV、TP2.双抗原夹心法：HBsAb3.竞争法:HBcAb、HBeAb

4.捕获法（反向间接法）：HAV-IgM、HBc-IgM

ELISA影响因素固相载体抗原试验样品酶结合物洗涤剂与稀释剂底物作用时间结果判断试验的重复性

医大二院学习报告报告复检检测加样准备样品接收样品编号扫码离心HAV、HBV、HCV、HEV、HIV：手动酶免法检测HIV：胶体金法TP：TPPA检测

胶体金免疫层析技术（GICA）胶体金胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸