分子生物学常用技术下.pptVIP

1.样品处理：RIPA裂解，超声，离心，总蛋白浓度2.SDS:分离胶浓度3.转膜：-滤纸-胶-NC膜-滤纸+，条件4.丽春红染色：丽春红5.封闭：5％脱脂奶粉-TBST，RT1h摇床6.Ab1：1:50~1:3000(封闭液)，RT1h/4℃过夜7.洗膜：TBST，RT1h，换液，摇床8.Ab2：1:3000(封闭液)，RT40min，摇床9.洗膜：同前10.ECL显色：RT5min，暗室，X-光片生物芯片：包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片三类芯片：在有限的材料表面固定大量的样品，一次试验可对很多的基因或蛋白进行检测。基因芯片：又称DNA微阵列或DNA芯片，是在基片上面积很小的区域内有序地固定大量的基因探针组成。种类：寡核苷酸芯片和cDNA芯片制备方法：直接点样法：寡核苷酸芯片和cDNA芯片原位合成法：寡核苷酸芯片基因芯片a.探针(DNA或cDNA)固定:以高密度点阵的形式按一定顺序固定排列在硅片(玻片、尼龙膜等)表面上b.待测样品标记:DNA、RNA或cDNA用荧光标记c.杂交d.检测:读片仪一次实验，DNA芯片便能记录成千上万的基因表达图谱。基因表达：直接检测mRNA的种类及丰度，是研究基因表达的有力工具。基因测序基因突变和基因诊断：大规模地筛查由基因突变引起的疾病，辅助疾病的诊断。功能基因组研究应用：3.DNA序列测定化学裂解法：Maxam和Gilbert，1977，可用于补充DNA测序结果，常用于难以用酶末端终止法测序的特殊DNA序列及结构。酶末端终止法：Sanger和Nicklen，1977，又称为双脱氧链终止法。自动化程度高，且在技术上不断进步。如荧光标记DNA测序技术、毛细管测序仪等。全基因组鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，不需要预先构建基因组的物理图谱，CeleraGenomics公司用以人类基因组测序。逐个克隆鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，需预先构建基因组的物理图谱，人类基因组计划公共联盟采用这个方法用于人类基因组测序。杂交测序：借助于基因芯片01先将DNA的末端之一进行标记(32P)；02在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；03在修饰碱基位置化学法断开DNA链；04聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；05根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。(1)化学裂解法(2)Sanger双脱氧链终止法PaulBergWalterGilbertFrederickSanger“在核酸碱基序列测定的贡献”1980年诺贝尔化学奖“在核酸生化，尤其是DNA重组的基础研究”逐个克隆鸟枪法测序全基因组鸟枪法测序杂交测序：是以基因芯片为基础的一种测序方法，01将一段DNA片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，02将这些八聚体做成基因芯片与待测DNA杂交，03根据杂交结果拼凑出所测DNA序列。04生物信息学分析技术概念：是生物学和信息技术的结合，利用计算机对大量生物数据进行分析。组成：数据库：数据采集，包括DNA/RNA/蛋白质测序，蛋白质的结构，基因/蛋白质表达数据，蛋白质相互作用数据。算法和统计方法：确定大数据集中各成员的关系对生物数据的分析和解释：生物数据的检索Entrez,NCBI,BLAST5%55%30%10%动物模型定点突变技术蛋白质相互作用基因表达谱和表型变化线索：生物信息学五、基因功能研究的方法方法1.转基因动物直接转染或用反转录病毒感染胚胎干细胞，然后将这些细胞移植到囊胚发育阶段的胚胎中；b.用反转录病毒感染早期胚胎；c.将包含目的基因的DNA显微注射到卵母细胞、受精卵或早期胚胎细胞中；d.雄配子介导的基因转移；e.将目的基因转移到未受精的卵细胞中；f.通过基因枪和电融合等物理方法进行基因转移。2007年诺贝尔生理学或医学奖MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSm