DB37T 2032-2012 布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术　.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB37

山东省地方标准DB37/T2032—2012

布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术

CompetitiveEnzyme-linkedImmunoassayDiagnosticCriteriaonBrucellaInfection

2012-02-09发布2012-03-01实施

山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T2032—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业科学院提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：杨宏军、田夫林、何洪彬、侯明海、仲跻峰。

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DB37/T2032—2012

布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术

1范围

本标准规定了动物布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术的操作要求。本标准适用于动物布鲁氏菌感染特异抗体的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18646-2002动物布鲁氏菌病诊断技术GB19489-2008实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

布鲁氏菌病Brucellosis

布鲁氏菌（Brucella）感染引起的急性或慢性人兽共患传染病，表现为流产，主要感染山羊、牛、猪及绵羊等，可导致人发热出汗、肝脾肿大、骨关节炎、睾丸炎和心内膜炎。

4试剂及仪器

4.1试剂

流产布鲁氏菌光滑型脂多糖抗原包被的微量板冻干单克隆抗体

辣根过氧化物酶标记交联物

20倍浓缩吐温磷酸盐缓冲液PBS-Tween样本稀释缓冲液

底物溶液（含H2O2的四甲基联苯胺底物缓冲液,避光！）终止液（含硫酸）

A阳性对照血清

B阴性对照血清

C弱阳性对照血清

4.2仪器

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DB37/T2032—2012

精密移液器（5-200μL）酶标仪，450nm滤光片

5检测方法（竞争酶联免疫吸附试验）

5.1样品的采集和处理

被检动物血液采集及血清分离参照GB/T18646-2002。

5.2操作步骤

5.2.1试验所有试剂回温到18-25℃。

5.2.2对照和样本的稀释

在微量板内直接稀释样本和对照：在微量板孔内加入45μL样本稀释缓冲液。

a)加入5μL血清对照。分别于适当孔内加入阳性对照、弱阳性对照和阴性对照。

b)在2个适当的孔内（作为交联物对照控制，Cc）加入5μL样本稀释缓冲液。

c)在每个待检孔内加入5μL样本。为试验控制，建议样本设重复（1次）。5.2.3所有对照和样本孔内加入50μL单抗溶液（加入时间差小于10min）。

5.2.4将微量板密封后于振荡器上震荡5min以充分混合。

5.2.5室温（18-25℃)孵育30min。

5.2.6以PBS-Tween缓冲液洗涤微量板4次，每次洗涤各孔充满、空净、叩板。

5.2.7每孔加入100μL交联物溶液，将微量板密封后室温孵育30min。

5.2.8重复步骤5.2.6。

5.2.9每孔加入100μL底物溶液，并在室温条件下孵育10min。第一孔加入后开始计时。5.2.10每孔加入50μL终止液，混合均匀，终止反应。终止液加入顺序同上一步。

5.2.11于酶标仪450nm读取对照和样本的光密度值（OD），以空气作为空白，应在加入终止液15min内读取。

6结果判定

6.1计算每一对照和样本的平均OD值。

6.2按照下列公式计算对照和样本的百分抑制值（PI）

PI=100-(平均OD样本/对照*100)/平均OD交联物对照控制Cc根据下列标准值范围确定本试验数据的有效性。

ODCc0.75-2.0

PI阳性对照85-110

PI弱阳性对照30-60

PI阴性对照-10-15

6.3检测样本结果

试验有效条件下，根据下列范围确定所检测样本的结果。PI值