DB12_T 1190-2023 牛乳中A2型β―酪蛋白(A2奶）鉴别技术规程.docx

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ICS65.020.30CCSB45

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天津市地方标准

DB12/T1190—2023

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鉴别技术

规程

CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incowsmilk

2023-04-07发布2023-05-07实施

天津市市场监督管理委员会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：天津市农业科学院。

本文件主要起草人：马毅、谭冬飞、陈丽丽、赵康、张漫、芦娜、王丽学。

I

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牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鉴别技术规程

1范围

本文件规定了的牛奶中A2型阝-酪蛋白（A2奶）的检测原理、主要试剂配制、主要仪器设备、质谱检测及数据处理参数、检测方法、结果判定、废弃物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施。

本文件适用于牛奶和奶粉中A2型阝-酪蛋白（A2奶）的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2

阝-酪蛋白由209个氨基酸组成，其一级序列中的第67位氨基酸的种类为脯氨酸（Proline,P）时，称为A2型阝-酪蛋白。

3.2

A2奶A2milk

所含阝-酪蛋白为A2型的牛奶。

3.3

质荷比mass-to-chargeratio

离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。

4检测原理

阝-酪蛋白变体型对应的氨基酸突变位点为第67位组氨酸（Histidine,H）突变为脯氨酸（Proline,P），不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据差异肽段的分子量及质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同突变体型阝-酪蛋白检测的目的。

5试剂配制

实验所用水为符合GB/T6682规定的一级水；高压灭菌条件为121℃,1.034*105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制如下：

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——样品裂解液：将480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L；

——10%SDS（十二烷基硫酸钠）：将10gSDS粉末溶于80mL蒸馏水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的滤膜过滤，高压灭菌；

——30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL；

——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：将181.65gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至8.8，容至1000mL；

——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：将121.1gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至6.8，容至1000mL；

——10%过硫酸铵：将10g过硫酸铵粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL；

——考马斯亮蓝染色液：量取甲醇45mL，蒸馏水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考马斯亮蓝R-250；

——考染脱色液：50mL碳酸氢铵/乙腈=1：1；

——1μg/μL胰蛋白酶：将100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃储存；

——25mmol/L碳酸氢铵：将2.0碳酸氢铵溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L。

6仪器设备

6.1单道可调移液器

0.25～2.5μl、1～10μl、2～2