电镜样品的基本制备技术之负染色技术.ppt

关于电镜样品的基本制备技术之负染色技术第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制，目前还不够清楚。第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日负染色技术首先，由Ha11（1955）、Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离的细胞器等研究工作。第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日特别是在病毒学领域，负染色更能发挥其独到作用，是一项很重要的实验技术。第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日—、负染样品的制备负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部制备过程分述于下。第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日（—）浓缩取样法适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。１．红细胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞表面；第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日2．低渗释放法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液滴膜染色。第8页，共38页，星期日，2025年，2月5日3．抗体病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。第9页，共38页，星期日，2025年，2月5日（二）直接取样法对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊断．第10页，共38页，星期日，2025年，2月5日对于生长在固体培养基上的微生物，可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采用直接取样法。第11页，共38页，星期日，2025年，2月5日（三）离心提纯法用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。第12页，共38页，星期日，2025年，2月5日二、染液的配制一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染色前应用：第13页，共38页，星期日，2025年，2月5日１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。第14页，共38页，星期日，2025年，2月5日作为负