羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作.ppt

********************************************（一）消化法（1）经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪将绒毛组织剪碎,放入装有30-50倍组织量的0.25%EDTA-trypin的三角烧瓶中，37℃下,20-30min即可(2)将三角烧瓶中的组织溶液装入离心管，离心,1000rpm,10min第55页，共64页，星期日，2025年，2月5日(3)去上清，加入20mlPBS,打匀(4)离心,1000rpm,10min(5)去上清，加入20mlPBS,打匀(6)细胞计数：106/25cm2接种第56页，共64页，星期日，2025年，2月5日(二)贴壁法经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪剪成1-2mm3小枝或小块，移入25cm2培养瓶中，用牙科探针将组织均匀分散于培养瓶的细胞贴壁面，组织块的间距约为0.5cm-1cm,于对侧瓶壁加入含50%血清的培养基，pH为7.2-7.4，37℃培养2-3小时待组织贴壁牢固后，即可翻瓶，使组织块泡在培养液中第57页，共64页，星期日，2025年，2月5日(三)收获细胞及染色体制片每天观察，一般3-7天可见上皮样或成纤维样细胞生长。根据生长情况每隔5-7天换液一次。一般培养6-20天，待细胞生长旺盛时，按下列程序处理：第58页，共64页，星期日，2025年，2月5日加入秋水仙素0.02-0.04ug/ml让其过夜，约14小时左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收获将培养液倒入离心管中，加入PBS或生理盐水2-3毫升，洗净完全培养基，加0.25%EDTA-trypsin约2ml消化3-5min，完全培养基终止消化。置离心管中离心，1500rpm，10min第59页，共64页，星期日，2025年，2月5日低渗：加入0.075MKCl4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%柠檬酸钠1∶1作为低渗液,每管8ml，低渗10min)预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37℃水浴3min，离心,1500rpm,10min固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37℃水浴15min第60页，共64页，星期日，2025年，2月5日室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml重复固定：同上离心，1500rpm，10min，去上清视管底细胞量加入适当几滴新鲜固定剂第61页，共64页，星期日，2025年，2月5日滴片：每片1-2滴,滴片4-6张烤片：75℃烤箱烘烤3小时第二天行显带处理：同外周血第62页，共64页，星期日，2025年，2月5日注意事项严格无菌操作是培养成功的关键；视细胞分裂旺盛情况加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、4-6小时也可考虑收获；在用0.25%EDTA-trypsin消化之前尽量将瓶壁血清洗净，更有利于快速消化；低渗之后每一步均应轻吹打，用力过大可能损失掉较多细胞。第63页，共64页，星期日，2025年，2月5日感谢大家观看第64页，共64页，星期日，2025年，2月5日********************************************细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。第23页，共64页，星期日，2025年，2月5日(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。第24页，共64页，星期日，2025年，2月5日细胞系细胞类型种组织培养基HeLa上皮细胞人子宫颈癌MEM,10%胎牛血清和NEAAHEp-G2上皮细胞人肝细胞癌MEM,10%胎牛血清和NEAAHT-1080上皮细胞人纤维肉瘤MEM,10%HI胎牛血清和NEAAHT-29上皮细胞人结肠腺癌McCoy5A,10%胎牛血清JEG-2上皮细胞人绒毛膜癌MEM,10%胎牛血清KB上皮细胞人口腔癌MEM