分子克隆与基因工程.ppt

轉基因生物、化學、物理方法以及它們的綜合利用。雙子葉植物常用根癌農桿菌介導進行轉化單子葉植物則是基因槍法使用較多哺乳動物轉基因常用磷酸鈣轉染、基因打靶 大多數化學和物理方法可作用於所有生物，如顯微注射、PEG、脂質體、電穿孔等1．細胞融合10-62．微細胞介導的基因轉移小於或等於10-63．染色體介導的基因轉移10-6利用中期染色體DNA進行轉移4．脂質體介導的基因轉移約2×10-4先用脂質體包裝DNA，然後與細菌，植物原生質體融合5．磷酸鈣沉澱介導基因轉移10-3—10-76．原生質體融合術約0.1—0.3%溶菌酶處理細菌，再與動物細胞，植物原生質體融合7．顯微注射法約1—10%直接注射入細胞質或細胞核內顯微注射法—利用顯微操縱器，將DNA直接注射到細胞核中穿刺法—利用注射顯微鏡將微注射針固定，然後穿刺將DNA注入細胞核內8．電脈衝介導的基因轉移10-4利用電脈衝改變生物膜透性，DNA可直接進入各種細胞9．重組RNA病毒感染約10—100%適用於動植物細胞10．重組DNA病毒感染約100%適用於各種細胞11．直接轉化法 包括：完整細胞或原生質體與DNA直接接觸，DNA進入細胞內，這種方法適用於細菌，酵母菌，真菌和植物細胞。12．接合轉移法適用於細菌之間和細菌與植物細胞之間，這種DNA轉移是借助於某些質粒上的轉移基因產物13．超聲波法現已用於植物細胞，可能還可用於其他生物14.基因槍法轉移方法的選擇選擇方法的依據：1．轉化頻率取決於以下幾個因素：1)外源DNA能否易於進入宿主細胞；2)重組DNA分子能否自主複製3)標記基因表達效率2.檢測轉化體的方法：是否具有選擇壓力3.生物材料的種類：細胞大小，有無細胞壁，除去細胞壁後的原生質體能否易於再生4.已有實驗條件：儀器，載體種類等分子克隆與基因工程基因本身就是一個產業Rockfeller大學將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經免疫因數配體轉讓達3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉讓225種基因的開發權（1998年9月）基因工程試劑的高回報鹼性成纖維細胞生長因數231元/ug紅細胞生成素1072元/ug白細胞介素-2410元/ug巨細胞粒細胞集落刺激因數1960元/ug胰島素10.2元/mg基因工程的概念從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，利用DNA體外重組，經過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分子，再將其轉入適當的受體細胞，以期獲得基因表達的過程.基因工程技術及其應用基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用:遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時是指基因的分離與重組過程。基因工程的特徵與主要步驟兩個特徵：第一，跨越天然物種屏障，克服了固有的生物種間基因交流的限制，第二，使一種特定的DNA小片段在新寄主細胞中擴增，製備大量純化的DNA片段，從而拓寬了分子生物學的研究領域主要步驟1.分離出帶有目的基因的DNA片段；2.構建重組DNA分子；3.轉化適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）並與之一起增殖；4.篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，並篩選出已經得到擴增的目的基因；5.將目的基因克隆到表達載體上，轉基因，在新的遺傳背景下表達基因工程流程目的基因的克隆目的基因：已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或