茅版第八章基因重组.pptVIP

4）Holliday中間體：切口封閉形成Holliday中間體(d,e)；5）分支遷移：兩條DNA分子間的交叉點可以沿DNA移動；移動實際上是兩條DNA分子間交叉的同源單鏈互相置換的結果(f);6）Holliday中間體旋轉變構(hi)；7）Holliday中間體拆分（二次切斷），可以有兩種情況：Holliday中間體二次切割發生在原斷裂的兩條單鏈上，則基因組未發生重組，但雙鏈中存在異源區域(圖j,k,l)；Holliday中間體二次切割發生在另外兩條單鏈上，則基因組發生重組(圖j’,k’,l’)。Holliday模型1.聯會：同源雙鏈配對；2.切刻：聯會兩分子中各發生一個單鏈斷裂；3.鏈交換：斷裂單鏈進行重新堿基配對交換，形成Holliday構型；4.分支移動：使Holliday構型交叉點移位；5.產生二次切刻；6.切刻封閉產生重組分子。3、修復重組的雙鏈斷裂模型4、環狀DNA同源重組過程1）雙鏈環狀DNA同源重組形成每條DNA分子首尾相連的8字型中間體；2）8字型中間體的拆分有兩種形式：一是產生兩個親體環狀DNA分子，但每個各含有一段異源雙鏈區；產生一個由兩個親體DNA分子首尾共價連接而成的二聚環。5、同源重組模型的實驗驗證Holliday中間體的電鏡觀察：電鏡下可觀察到?X174、大腸桿菌質粒等的“8”字形結構；用單一切點酶處理“8”字形分子，則形成具有兩對相同長度臂的?型分子(b,c)，說明兩個分子通過同源區共價連接的。四、細菌的重組1、轉化中的重組感受態細胞表面有一種DNA結合蛋白因數，特異性結合雙鏈DNA；在內切核酸酶作用下，一條鏈被降解，另一條鏈被吸收到細胞質內；被吸收的單鏈DNA與蛋白質結合生成遮蔽複合物，保護單鏈DNA免受核酸酶的降解；“遮蔽”複合物把單鏈DNA帶至受體染色體，通過彼此的重組，單鏈DNA片斷整合到染色體上，置換了宿主染色體的同源部分生成帶有錯配堿基對的雜合區；整合過程中產生的錯配通過修復機制進行修復。轉化機制轉化過程中recA蛋白質起著重要作用2、細菌接合中的重組1）接合：細胞直接接觸，供體DNA通過專門的接合管轉移至受體細胞，過程由致育因數F質粒來完成；2）接合重組過程F+細胞性纖毛與F?細胞表面特異識別位點作用，形成接合管或接合橋；當接合發生在F+及F?之間時，F質粒編碼的特異內切酶在oriT位點上打開缺口，F-DNA的一條單鏈留下複製恢復其雙鏈狀態，另一條進入受體細胞的單鏈以不連續方式合成互補鏈。染色體上一些特殊區域與F因數的某些部位有同源性，可以讓F因數插入，生成Hfr細胞；當Hfr與F?結合時，Hfr染色體的轉移是以單鏈形式進行，並以單鏈形式通過一般重組與寄主染色體整合；F質粒整合需要寄主重組系統RecA蛋白和RecBC蛋白。F因數插入模型染色體上一些特殊區域與F因數的某些部位有同源性，可以讓F因數插入，生成Hfr細胞。3、細菌轉導中的重組1）轉導：供體細胞基因通過噬菌體運載進入受體；普遍性轉導：被轉導DNA片斷是隨機的；專一性轉導：轉移的染色體DNA是特定片斷。2）轉導重組的一般特徵轉導遺傳重組都在雙鏈DNA片段和完整DNA分子間發生；轉導的重組過程與兩個完整DNA分子的重組相類似，起始於單鏈侵入和取代；轉導也需要RecA和RecBC蛋白質。五、同源重組過程的酶學1、RecA蛋白又稱做重組酶，分子量約38kD，由recA基因編碼，為含4個亞基的四聚體；2、RecA是同源重組最重要的蛋白，主要功能是促進DNA分子同源聯會和DNA分子間的單鏈交換。（一）RecA蛋白質3、與重組有關的活性單鏈DNA結合活性：形成的複合物是DNA單鏈交換中的活性形式；雙鏈DNA結合活性：依賴於ATP，RecA與雙鏈DNA結合導致解鏈，並最終促使RecA與單鏈DNA的結合；NTP酶活性：單鏈或雙鏈DNA存在時，該蛋白可水解NTP並與DNA結合；但只有ATP水解才能促進聯會；促進互補單鏈複性的能力。4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先與單鏈DNA結合（約每分子可結合５個核苷酸），形成一條DNA－蛋白質細絲（需消耗ATP），RecA蛋白即被活化；活化的RecA將雙螺旋解旋和分離，同時試圖將其結合的單鏈與被解旋區域退火，如此繼續，直到找到互補順序。一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供應的能量就會繼續驅使配對反應趨於完成，其方向是５’→３’（單鏈部分）。新的雜交雙鏈形成時，RecA蛋白即從原來的單鏈掉下來。生物的基因並不是一成一變的，除了各種突變以外，基因重組也為生物的變異增添了新的內容。基因重組或稱遺傳重組不是偶然的，而是一個必要的