茅版第六章遗传物质的复制.ppt

（二）噬菌體DNA複製的引發1、單鏈噬菌體DNA複製的不同引發方式G4噬菌體不用RNA聚合酶，而由dnaG編碼的蛋白負責引發，即引發酶；M13噬菌體以E.coli常用的RNA聚合酶來合成引物；?X174複製RNA引物的合成需更多蛋白因數，這一蛋白複合物稱引發體（primosomecomplex)；?X174是多位點引發，而另兩種噬菌體使單一位點。2、引發酶引發酶是一種特殊的RNA聚合酶，由dnaG編碼，比一般的E.coliRNA聚合酶小，分子量為65kD。單鏈噬菌體DNA複製中RNA引發的三種機制3、?噬菌體的複製起始?複製原點大約是350bps，包括：4個高度保守的19bp組成的正向ori重複序列，40bp組成的富含A/T序列，28bp的回文序列；PROR發動的轉錄是?DNA複製必需的，一方面使複製原點解鏈，另一方面轉錄了基因O和基因P；O蛋白的結合位點是四個ori重複序列，O蛋白與P蛋白可以相互作用，而P蛋白與DnaB基因產物相互作用。形成起始複合物DnaA與複製原點的4個9聚體DNA序列結合，不需要ATP；形成開放複合物DNA在13聚體處熔解，需要ATP和控制DNA結構的HU蛋白形成預引發體DnaB解旋酶在DnaC的幫助下定位，DnaC從複合物中釋放形成引發體DNA被DnaB解鏈，引發酶加入DNA合成延伸徵集拓撲異構酶和SSB，在polIII作用下延伸開始（三）大腸桿菌雙鏈複製的起始E.Coli複製起始大腸桿菌複製起點oriC最小序列245bp，含有4個9bp和3個13bp的特徵DNA序列；9bp是DnaA結合位點，20-40個DnaA單體順序結合oriC形成中央核心；3個13bp重複區段是AT豐富區，在DnaA蛋白作用下熔解；DnaB和DnaC蛋白以聚集物形式與開放複合物發生蛋白-蛋白相互作用，DnaB起解螺旋作用，形成雙向複製叉；DnaB具有促進引發酶結合，完成引發體的組裝；兩種蛋白質參與解旋反應，旋轉酶（gyrase）使一鏈繞另一鏈旋轉，釋放因解旋導致的DNA鏈扭曲，單鏈結合蛋白（SSB）穩定單鏈DNA。電鏡下複製起點結構OriC形成的複合物。上面顯示了複製前的預引發體複合物，下麵顯示起始複製1分鐘後複製泡的複合物，兩種複合物均可通過DnaB抗體作用觀察到。E.coli複製起始有關的酶和蛋白質1、複製叉的組裝與反應複製叉組裝階段I：起始因數DnaA對複製原點的識別和雙螺旋DNA解鏈的開始；階段II：荷載因數DnaC和解鏈酶以複合形式吸納到複製起點，雙鏈DNA解開，形成單鏈範本，形成複製叉。二、複製延伸過程DNA複製延伸的5個階段雙鏈DNA不斷解螺旋；前導鏈DNA的合成；後滯鏈不斷合成新的RNA引物；合成岡崎片段；RNA引物去除，岡崎片段連接。2、雙鏈複製回環模型1）複製體（replisome）DNA聚合酶III是不對稱二聚體，有兩個DNA合成的催化中心；在複製叉處，DNA聚合酶III和引發體以及其他複製蛋白構成複製複合體；每個複製中心含有兩個?亞基，兩個?亞基和兩個ATP分子；?亞基負責將DNA聚合酶III結合為二聚體。DNA複製延伸時，前導鏈和後滯鏈的合成各利用DNA聚合酶III的一個催化中心；後滯鏈的範本圍繞其中一個催化中心折疊成環狀，使後滯鏈方向顛倒，但生化反應方向不變。使前導鏈和後滯鏈同時合成。2）雙鏈複製回環模型2）後滯鏈合成機制後滯鏈範本在DNA聚合酶III全酶上繞180?C形成一個環；環上RNA引發酶形成引物，DNA聚合酶隨後延伸，DNA聚合酶沿複製叉移動，複製片段延長，環變大，直至遇到下一個岡崎片段，釋放環。模型的關鍵在於前導鏈與後滯鏈合成的進行性及DNA聚合酶的不對稱性。原核生物聚合酶III二聚體不對稱。三、複製的終止1.大腸桿菌的複製有固定的終點終止子(terminator)：染色體和質粒DNA中複製終止的特定序列；2個終止區域：每個區域含有若干個終止子(terE,D,A和terC,B)，每個終止區可終止一個方向複製叉運動。2.多數環狀DNA複製沒有固定終點，僅是兩個生長點的簡單碰撞。3.環狀分子複製後產生環連分子(catenane)，在拓撲異