基因工程-2分子的杂交.pptVIP

3)标记化合物的纯化ii.旋转柱层析快速，简便,可同时纯化多个样品。i.柱层析利用SephadexG-50，前峰-标记物，后峰-核苷酸2.4分子杂交与结果检测核酸杂交与结果检测01预杂交：预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合,42℃4-6h或过夜。02杂交：探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天03洗涤：2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算：T=4GC+2AT高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。1若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶：2i.辣根过氧化物酶:可将3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。3放射自显影或显色反应ii.碱性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。iii.两种酶偶联物的比较碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大。ii)碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。杂交结果12345检测重组体克隆的菌落杂交技术经固定剂处理的细胞被黏附在载玻片上，然后用核糖核酸酶和氢氧化钠降解RNA，并使DNA分子变性，单个多聚核苷酸链之间的配对碱基被拆散，而且染色体也在一定程度上被拆开，暴露出通常被包裹在它们结构之中的DNA片段。将一定量的被标记的基因掺入到制备好的染色体中。标记基因和它的染色体拷贝杂交，最终在放射性自显影中形成一个黑点。这个黑点的位置表示标记的基因在染色体上的位置。尽管技术较难，但人们已经利用原位杂交和放射性标记的探针，定位人类细胞遗传图谱上相当数量的基因。原位细胞杂交人们用荧光标记物替代放射性标记，将它连接到杂交探针上，探针与DNA分子杂交后，可以通过荧光显微镜直接观察实验结果。如果使用不同的荧光染料，可以同时探测两个或更多的基因，通过荧光颜色间明显的差异可以分辨出不同的杂交信号。FISH经常与已知正常染色体位置的探针一起使用，这项技术对于研究染色体已经重新排列的细胞特别有用。染色体重新排列，例如染色体复制，或者是某一DNA片段从一条染色体转移到另一条染色体上，都能够通过FISH相对较快地测定出来，比传统的染色技术快很多。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)12345先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：i.扩散法ii.毛细管法iii.电泳转移法iv.真空转移法转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization)12夹心杂交法(sandwichhybridization)它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品010201制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。1)DNA和RNA的杂交制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA）或→一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）2）蛋白质的免疫分析2分子杂交的一般程序2.1杂交样品膜的制备固定基质的种类与特性硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000）优点：ii.用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要预激活；易于操作