环境污染的生物学效应检测.ppt

1.2试验方法致突变试验的目的致突变试验的目的是为了检查受试物对机体是否有致突变作用。致突变试验方法体外基因突变试验，例如Ames试验，哺乳动物体细胞株突变试验。细胞遗传学试验，例如，染色体畸变试验，微核试验。体内基因突变试验，例如，显性致死突变试验，果蝇伴性隐性致死试验。DNA损伤试验，例如，姐妹染色单体交换试验，DNA修复合成试验。第63页，共109页，星期日，2025年，2月5日A.Ames试验Ames试验原理同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。注释1：营养缺陷型突变型菌株注释2：野生型微生物第64页，共109页，星期日，2025年，2月5日鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his－），回复为能自行合成组氨酸的（his＋）菌落数。突变率＝诱发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。第65页，共109页，星期日，2025年，2月5日B微核试验原理：微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。第66页，共109页，星期日，2025年，2月5日微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分开及与核突出物相区别，故常计数多染红细胞（PCE）中的微核，因为当原成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。第67页，共109页，星期日，2025年，2月5日第68页，共109页，星期日，2025年，2月5日第69页，共109页，星期日，2025年，2月5日动物选择：首选物种是小鼠和大鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。染毒次数及取样时间：不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4d，第5天取样。第70页，共109页，星期日，2025年，2月5日剂量选择：受试物的最大剂量除因溶解度所限外，应达最大耐受量，或参考毒物的LD50，以80％LD50为最高剂量。在一般情况下，应设4～5或更多试验组，剂量水平跨3个以上数量级。另设阳性和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50～100mg/Kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射一次或二次。阴性对照组使用等体积的溶剂。第71页，共109页，星期日，2025年，2月5日骨髓液的制备、涂片、固定、观察计数。PCE呈灰（淡）蓝色，NCE呈淡红色。计数200个红细胞中PCE数和PCE百分比正常的PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.6～1.2)。如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如比值＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。第72页，共109页，星期日，2025年，2月5日C.果蝇伴性隐性致死试验原理：根据隐性基因在性遗传中的交叉遗传特征，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上的隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变的存在。第73页，共109页，星期日，2025年，2月5日CIB法果蝇有一个品系称ＣlＢ系：Ｘ染色体上有一个大的倒位Ｃ；隐性致死突变ｌ；显性棒眼基因Ｂ。由于ｌ基因而使雄果蝇不能存活，Ｂ基因可作为标记，凡带有ＣlＢX染色体的雌果蝇可以从棒眼性状上加以辩认，大的倒位Ｃ可以抑制ＣlＢX染色体与另一同源染色体交换。检测的方法是让受检的雄果蝇与ＣlＢ雌果蝇杂交，所生子代应为２♀：１♂。在雌蝇中有半数带ＣlＢ，可以从棒眼上加以辩认，在这些棒眼雌蝇中的两条Ｘ染色体，一条是ＣlＢ，另一条是受检雄蝇来的Ｘ染色。将这一棒眼雌性与正常雄