DB37T 3005-2017 猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术.docxVIP

ICS11.220B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T3005—2017

猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术

TechnologyofIsolationandRT-PCRdetectionofPorcineEpidemicDiarrheaVirus

2017-08-18发布2017-09-18实施山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T3005—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、李俊、杜以军、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。

本标准为首次发布。

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DB37/T3005—2017

猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术的要求。

本标准适用于猪肠道内容物、排泄物或乳汁样品中猪流行性腹泻病毒的分离与检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DEPC水：DEPC(Diethypyrocarbonate)处理并灭菌后的去离子水。DMEM:细胞培养基(DulbeccosModifiedEaglesMedium)。

PEDV:猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus)。

双抗：青霉素、链霉素混合液(Penicillin-StreptomycinSolution)。CPE:致细胞病变效应(cellcytopathiceffect)。

4仪器与试剂

除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》,所用化学试剂应为分析纯。

4.1病毒分离需要的仪器与试剂

4.1.1微量可调移液器(最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL)。

4.1.220000g高速冷冻离心机。

4.1.3高压灭菌锅。

4.1.437℃二氧化碳细胞箱。

4.1.5II级生物安全柜。

4.1.6超低温冰箱：可控温至-70℃。

4.1.7PBS。

4.1.8双抗(100×)(青霉素10000IU/mL,链霉素10000μg/mL)。

4.1.9DMEM培养基。

4.1.10Vero细胞。

4.1.11新生胎牛血清。

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4.1.12胰酶。

4.1.13一次性25cm2细胞培养瓶。

4.1.14一次性10mL吸管。

4.1.15一次性0.22μm滤器。

4.1.161.5mL离心管。

4.2RT-PCR检测需要的仪器与试剂

4.2.1微量可调移液器(最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL)。

4.2.220000g高速冷冻离心机。

4.2.3PCR仪。

4.2.4高压灭菌锅。

4.2.5普通冰箱。

4.2.6超低温冰箱：可控温至-70℃。

4.2.7PBS。

4.2.81.5mL离心管。

4.2.9阳性对照：PEDVCV777疫苗毒株。

4.2.10阴性对照：DEPC水。

4.2.11引物：采用套式PCR进行扩增，设计2对引物。PEDV外F5-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3,PEDV外R5-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3,PEDV内F5-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3,PEDV内R

5-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3。

5方法

5.1样品采集

5.1.1活体采样

采集腹泻猪