分子生物学实验技术教学课件.pptVIP

*************************************Westernblot技术蛋白质分离SDS分离蛋白质混合物转膜电转法将蛋白从凝胶转至PVDF或硝酸纤维素膜封闭用BSA或脱脂牛奶阻断非特异性结合抗体孵育与检测一抗和二抗孵育，ECL或其他方法显影Westernblot（蛋白质印迹法）是一种特异性检测复杂样品中目标蛋白的技术，结合了SDS的分离能力和抗原-抗体反应的特异性。转膜步骤通常采用半干法或湿转法，将凝胶中的蛋白质转移到固相膜上。常用膜有PVDF膜（疏水性强，蛋白结合力高，适合后续分析）和硝酸纤维素膜（背景低，适合ECL检测）。抗体孵育包括一抗（特异识别目标蛋白）和二抗（结合一抗，通常偶联HRP或荧光团）两步。检测方法主要有：化学发光法（ECL，最常用，灵敏度高）；比色法（如DAB显色，直观但灵敏度低）；荧光法（多重检测优势，定量准确性高）。结果分析与优化：条带分子量与预期一致表明检测特异；信号强度可进行相对定量分析（通常需内参如β-actin或GAPDH校正）。常见问题及解决方案：背景高（增加封闭时间或洗涤强度）；无信号（检查抗体浓度和孵育条件）；多条带（优化抗体稀释或更换特异性更高的抗体）。免疫沉淀技术样品制备非变性条件下裂解细胞或组织1抗体孵育加入特异性抗体与目标蛋白结合蛋白A/G捕获加入蛋白A/G磁珠或琼脂糖沉淀抗体-蛋白复合物洗涤与洗脱去除非特异性结合蛋白，洗脱目标蛋白免疫沉淀（IP）是利用抗原-抗体特异性反应从复杂样品中分离特定蛋白的技术。其基本原理是：特异性抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再通过蛋白A/G（能结合大多数IgG的Fc段）将复合物沉淀，实现目标蛋白的富集和纯化。免疫沉淀关键步骤包括：选择高特异性抗体（单克隆通常特异性更高）；优化裂解条件（应保持蛋白质天然构象和相互作用）；控制抗体用量（过多会增加非特异性，过少则沉淀不完全）；严格的洗涤条件（平衡特异性沉淀和背景降低）。IP广泛应用于：蛋白质相互作用研究（共免疫沉淀，Co-IP）；蛋白质翻译后修饰分析（如磷酸化IP）；蛋白质纯化和富集；染色质免疫沉淀（ChIP，研究蛋白质与DNA的相互作用）；RNA免疫沉淀（RIP，研究蛋白质与RNA的相互作用）。酶联免疫吸附测定（ELISA）直接法ELISA将抗原直接包被于微孔板，加入酶标记的特异性抗体，发色底物显色。操作最简便但灵敏度较低，抗体需标记酶。间接法ELISA将抗原包被于微孔板，依次加入一抗和酶标二抗，发色底物显色。灵敏度较高，可使用相同的酶标二抗检测不同一抗，但步骤较多。夹心法ELISA将捕获抗体包被于微孔板，加入样品后再加入酶标检测抗体，发色底物显色。特异性和灵敏度最高，适合检测复杂样品中的抗原，但需要两种识别不同表位的抗体。竞争法ELISA样品中抗原与已知量的酶标抗原竞争有限的抗体结合位点，信号强度与样品中抗原量成反比。适合检测小分子抗原或低浓度样品。细胞培养基础无菌操作技术所有细胞培养操作应在超净工作台中进行，操作前用75%酒精消毒工作台表面和物品。培养基和试剂应进行灭菌或无菌过滤，避免交叉污染。操作者应穿隔离服，戴手套，熟练掌握无菌技术和防污染措施。2培养基选择常用基础培养基包括DMEM、RPMI1640、MEM等，根据细胞类型选择。完全培养基通常添加10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（青霉素-链霉素）和其他特定生长因子。无血清培养基适用于特定实验需求，可减少血清成分带来的干扰。3细胞传代与冻存贴壁细胞传代通常使用胰蛋白酶-EDTA消化，悬浮细胞可直接分装。传代比例和频率根据细胞生长特性确定。细胞冻存通常使用含10%DMSO的培养基，采用程序降温或细胞冻存盒，最终存储于液氮中。复苏时应快速解冻并立即稀释DMSO，以减少细胞毒性。细胞转染技术脂质体转染利用阳离子脂质体与带负电荷的核酸形成复合物，促进其穿过细胞膜。代表产品有Lipofectamine系列、FuGENEHD等。优点是操作简便，效率较高，适用于多种细胞类型；缺点是对某些细胞（如原代细胞）效率较低，且脂质体可能有细胞毒性。操作步骤：细胞铺板（通常50-70%汇合度）→DNA/RNA与转染试剂分别稀释→混合并孵育形成复合物→加入细胞→培养24-72小时检测表达。转染效率可通过荧光蛋白（如GFP）或报告基因系统评估。电穿孔法与病毒介导转染电穿孔法是通过短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使核酸进入细胞。适用于难转染细胞类型，如淋巴细胞、干细胞和原代细胞。优点是效率高，可同时转染多种核酸；缺点是需要专门设备，且可能造成较高细胞死亡