蛋白质SDSPAGE电泳注意事项.pdfVIP

匀浆：

1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。

2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。

3.所有操作尽量在冰上进行。

4.94℃水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事

先要打开升温）。

5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。

6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。

7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到

4℃，即可。

8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。

9.SDS,DDT,PMSF是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。

制胶：

10.APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。

11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。

12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。）

13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm的玻璃板用白色条带封底。（封紧以防

漏胶）

14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30mi。

15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。一般要

5-10分钟。而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。

16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的）

17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。

18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。

19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）

20.脱色时，尽量多次进行换水。

21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl.

22.做胶时，凝胶时间控制在25mi。梳子不能歪来歪去。

23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。

24.制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气

泡。

注意：温度，时间，光照，APS和TEMED都会对凝胶产生影响