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唾液代谢物分析实验操作流程

唾液代谢物分析实验操作流程

一、实验前准备与样本采集规范

（一）实验环境与设备校准

唾液代谢物分析需在恒温恒湿实验室进行，环境温度控制在22±2℃，相对湿度维持在40%-60%。超高效液相色谱仪（UPLC）需提前48小时开机预热，并进行基线漂移测试，要求基线噪声小于0.5mV。质谱仪需使用标准品（如亮氨酸-脑啡肽）进行质量轴校准，确保质量偏差小于2ppm。离心机需预先以3000×g空转10分钟验证转子平衡性。

（二）受试者筛选与采样控制

纳入标准为18-45岁健康成年人，采样前24小时禁食高色素食物（如咖啡、巧克力）并记录饮食日志。采用非刺激式唾液采集法：晨起空腹状态下，受试者静坐5分钟后，通过聚丙烯导管自然流涎至预冷离心管，采集量不少于2mL。样本需立即置于-80℃干冰转运箱，运输时间不超过30分钟。

（三）耗材预处理与质控

所有接触样本的耗材需经0.1%DEPC水浸泡12小时去除RNase。移液枪头需进行空白测试：吸取超纯水后液滴残留量应小于0.5μL。使用前需用0.22μm尼龙膜过滤的甲醇冲洗玻璃器皿3次，LC-MS级水冲洗2次。

二、样本处理与代谢物提取流程

（一）低温离心与蛋白沉淀

样本在4℃环境下解冻后，立即转入预冷转子进行两阶段离心：第一阶段3000×g离心10分钟去除上皮细胞，取上清液；第二阶段12000×g离心15分钟（转子温度保持4℃）分离粘蛋白。加入预冷甲醇（样本体积4倍）进行蛋白沉淀，涡旋振荡30秒后静置-20℃1小时。

（二）固相萃取与衍生化处理

使用OasisHLB固相萃取柱（60mg/3mL），依次用3mL甲醇、3mL超纯水活化。上样后先用1mL5%甲醇淋洗杂质，再用2mL80%甲醇洗脱目标代谢物。对氨基、羧基类化合物需进行BSTFA衍生化：取100μL洗脱液与50μL衍生化试剂在70℃反应30分钟，氮吹浓缩至50μL。

（三）同位素内标添加

每份样本加入10μL混合内标溶液（含d4-琥珀酸、13C6-葡萄糖等8种同位素标记物），涡旋混匀30秒后静置10分钟。设置三层次质控样本：空白基质（0.9%NaCl）、低浓度（50ng/mL标准品）、高浓度（500ng/mL标准品），与待测样本同步处理。

三、仪器分析与数据采集规范

（一）色谱条件优化

采用HSST3色谱柱（2.1×100mm，1.8μm），柱温40℃。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈。梯度程序：0-2分钟5%B，2-15分钟线性升至95%B，15-18分钟维持95%B，18.1分钟返回初始条件平衡5分钟。流速0.3mL/min，进样量2μL。

（二）质谱参数设置

电喷雾离子源（ESI）温度500℃，喷雾电压±4.5kV（正负离子模式切换）。鞘气流量45arb，辅助气流量15arb。全扫描范围m/z50-1000，分辨率70000（Orbitrap检测器）。数据依赖采集（DDA）模式下，选择强度前10的母离子进行二级碎裂，碰撞能量设置为20/35/50eV三阶梯。

（三）数据预处理与质量控制

原始数据经ProteoWizard转换为mzXML格式后，使用XCMSOnline进行峰提取（峰宽5-20s，SNR阈值3）。内标保留时间偏移需小于0.3分钟，峰面积RSD小于15%。每批次检测需满足：QC样本检出代谢物数变异系数（CV）30%，空白样本中不得出现目标代谢物峰（信噪比S/N3）。

四、方法验证与结果复核

（一）线性范围与灵敏度测试

配制0.1-1000ng/mL的7个浓度梯度标准品，绘制校准曲线。要求相关系数R2≥0.99，LLOQ（最低定量限）信噪比≥10。进行三批次日内精密度测试（n=6），RSD需小于15%；日间精密度测试（连续3天）RSD小于20%。

（二）基质效应评估

通过后灌注法测定：比较纯溶剂与唾液基质中添加相同浓度标准品的峰面积比值。要求内标归一化后的基质效应系数在85%-115%之间。对回收率低于70%或高于130%的代谢物需重新优化提取方案。

（三）生物标志物筛选验证

采用OPLS-DA模型分析组间差异，VIP值1且p0.05的代谢物进入候选列表。通过ROC曲线评估诊断效能（AUC0.7），并使用验证集（n≥30）进行盲法验证。对显著性差异代谢物进行KEGG通路富集分析，筛选关键代谢通路（FDR0.05）。

五、实验记录与数据管理

（一）电子化记录规范

使用LIMS系统实时记录样本编号、处理时间、操作者信息。关键步骤（如离心参数、衍生化温度）需拍摄数码照片并附带时间戳。所有修改记录需保留审计追踪（audittrl），修改者需输入双因素认